病菌抗药性最新进展及检测技术

1、病菌抗药性最新进展及检测技术摘要：本文从对几种植物病害抗药性的监测、病原菌交互抗性的研究、抗药性的遗传研 究论述了病菌抗药性的最新进展;从传统的检测技术和现代分子监测技术两方面说明了病菌 抗药性的监测技术。关键词：抗药性；进展研究；监测技术农用杀菌剂从19世纪80年代开始应用，至今为止，共出现了三大类杀菌剂:第一代以 二硫代氨基甲酸盐类为代表的杀菌剂是多作用位点的、广谱性的有机合成杀菌剂。长期大量 使用，会破坏环境的微生物平衡，且很有可能造成植物病害的猖撅发生。第二代杀菌剂以内 吸治疗为特点的，诸如苯并咪哇、氧硫杂艺类以及近年来出现的三哇类、咪哇类等麦角街醇 合成抑制剂，这类药剂的作用点单一，

2、容易出现抗药性。随着人们环境保护意识的增强，以 无毒性保护特点的第三代杀菌剂不断被研制利用;在杀菌剂的广泛应用中，不论那类杀菌剂， 都会出现抗药性的问题。随着科技的发展，病原菌抗药性的研究的一个热点问题。植物病原菌抗药性或杀菌剂抗药性，是指病原菌长期在单一药剂选择作用下，通过遗传、 变异，对此获得的适应性。联合国粮农组织(FAO)对杀菌剂抗药性推荐的定义是“遗传学为 基础的灵敏度降低”。特别是随着高效、内吸、选择性强的杀菌剂被开发和广泛应用，杀菌 剂抗性越来越严重和普遍，成为制约化学防治措施发展的关键因素之一。我国对杀菌剂抗药性的研究，从80年代初开始。近二十年中，着重对一些抗性问题严重 的病

3、害进行了研究。尽管我国的病菌抗药性工作研究得不很多,而且大多研究工作都着眼于 对病害抗性的监测与生物学特性等一些基础工作的研究上，但其无论在理论上还是在生产实 践上，都有重要的意义。1.病菌抗药性最新进展1.1对几种植物病害抗药性的监测1.1.1水稻稻瘟病水稻稻瘟病是中国水稻产区最重要的病害之一。以往一直采用稻瘟净、异稻瘟净和克 瘟散为主的有机磷类杀菌剂进行化学防治。沈嘉祥首先于19811987年对云南稻瘟病菌的抗 药性进行检测，发现少数地区开始对稻瘟净和异稻瘟净产生了抗性。此后，三环唑类药剂的抗 性也日趋明显。在我国胶东沿海小麦区,1994年小麦白粉病菌对三唑酮的抗药性进入发展初 期，抗性水

4、平为37倍，且抗性发展迅速。至1999年,黑龙江大部分稻区也对三环唑产生了低 水平的抗性。1.1.2水稻白叶枯病水稻白叶枯病是中国南方稻区的重要病害。多年来一直依靠中国自行研制的噻枯唑进 行化学防治。自1994年起对水稻白叶枯病原细菌对噻枯哇抗药性进行了连续监测，结果证 明所测江苏赣榆、安徽滁州地区的白叶枯病菌己产生了抗药性，抗药性菌株在病原群体中已 占40%以上，抗药水平中等。治理白叶枯病菌对噻枯唑的抗药性已刻不容缓。1.1.3灰霉病灰霉病已成为中国蔬菜、水果、花卉上的重要病害，特别在保护地造成的危害极大。 虽然具有多种杀菌剂可以被用来进行化学防治，但是该病原菌极易产生抗药性变异。用于防 治

5、灰霉病的杀菌剂有主要三类:苯并咪唑类、二甲酰亚胺类和乙霉威。周明国、叶钟音等首 先于1986年在南京草莓上检测到抗多菌灵的菌株。到1998年为止，华东、华北的大部分地 区都检测到既抗多菌灵、又抗速克灵的多抗菌株且抗性频率普遍很高。纪明山等于1997年 在辽宁检测到对多菌灵和其负交互抗性杀菌剂乙霉威双抗的灰霉病菌株，证明苯并咪唑类杀 菌剂与乙霉威的混剂用于防治灰霉病效果下降的原因是产生了新的双抗型菌株。1.2病原菌交互抗性的研究对苯并咪唑类杀菌剂的抗性研究表明：该类药剂之间存在交互抗性，且抗性水平普遍很 高，能稳定遗传。部分对多菌灵高抗的菌株对乙霉威敏感，而中低抗性的菌株对乙霉威的敏感 性与敏感

6、菌株相似;该类药剂与二甲酰亚胺类、传统保护剂等之间不存在交互抗性。二甲酰 亚胺类的速克灵、扑海因等之间存在正交互抗性,其与苯并咪唑类和传统的保护性杀菌剂之 间无交互抗性。卵菌的抗药性研究表明:不同的疫霉病菌对杀菌剂的抗性及交互抗性有明显 的差异。其对苯酰胺类的甲霜灵、恶唑烷酮之间存在交互抗性。黄瓜霜霉菌对甲霜灵与安克、 霜脲氰与乙磷铝、甲霜灵与乙磷铝之间无交互抗性;恶疫霉、大雄疫霉、苎麻疫霉等所试疫 霉对甲霜灵和霜脲氰均无交互抗性。因此，得出结论:霜脲氰可用于防治对甲霜灵类杀菌剂产 生抗性的病菌。1.3抗药性遗传研究病原菌抗药性遗传机理是抗药性研究的重要内容，它是正确设计和实施抗药性治理对策

7、的理论依据。在此方面,王源超、高智谋分别报道了恶疫霉突变株对甲霜灵的抗性在游动抱 子后代持续发生分离的现象，认为这种抗性性状可能由细胞质因子控制。苎麻疫霉对甲霜灵 的抗性遗传研究中发现了抗性的不稳定。罗赫荣等研究证明，抗甲霜灵的辣椒疫霉突变菌株 的抗药性经无性和有性生殖均能稳定遗传。在姐妹配对的F2代卵抱子群体，辣椒疫霉对甲霜 灵的抗性为不完全显性基因控制，而对霜脲氰的抗性为完全显性基因控制，二者为非连锁方式 遗传,即不存在交互抗性。2杀菌剂的抗药性监测病原菌对杀菌剂的抗药性监测在合理用药、及时调整抗药性治理策略的过程中起重要 作用。抗药性监测可以通过传统的抗药性监测方法和现代的分子检测方法实

8、现。2.1传统的抗药性监测传统抗药性监测方法（如菌丝生长法、抱子萌发法）需要分离大量纯培养的菌株放置到含 药培养基或喷洒药剂的植物组织上，这个过程耗时、费力，尤其对难培养的病原菌和活体寄 生菌的检测过程很难把握，且在抗药性个体频率低于1%以下时，难以用传统的方法检测到 抗药性菌株的存在，而对于基因组中控制抗性的突变位点不明确的病原菌或不具备抗药性分 子检测条件的单位，这种传统的抗药性监测必不可少。二甲酰亚胺类杀菌剂和苯基酰胺类杀 菌剂的抗药性检测目前主要以生物测定为主，因为病原菌对此两类杀菌剂的抗药性基因突变 位点目前还不清楚。目前主要以生物测定方法检测其抗药性存在与否。1998年和1999年

9、采 自乌干达不同地区马铃薯和番茄上的81个疫霉菌株利用菌丝生长法确定了高抗菌株已达到 了 44.4%，而中抗菌株占到23.5%。2.2抗药性分子监测为了尽早检测出田间是否已出现了植物病原菌的抗药性以及了解抗药性的产生机制和 发展动态，核酸水平的分子诊断技术应运而生，它不仅能够快速、准确、灵敏地检测出田间 早期出现的抗药性菌株和监测抗药性群体的发展动态，而且能够及时指导农民和农药企业调 整防治策略。既可确保药剂的防治效果，又能延长杀菌剂的使用寿命。现阶段，核酸分子诊 断技术检测杀菌剂的抗药性仅适用于：1）已知与抗药性相关的基因及其突变位点和突变类 型。2）抗药性菌株来自田间而非室内突变体，具有稳

10、定的生物学特性，最好是单抱分离的 菌株，能够代表田间抗性群体。3）基因组上的碱基突变与表现型之间关系明显。2.2.1.等位基因特异性扩增该方法的原理是:由于PCR过程中引物延伸是3端开始的，所以3末端的碱基对引物 的延伸至关重要。因此在引物设计中，根据已知突变位点在引物3端或中间设计一个错配碱 基，使之仅能与敏感型或抗药型互补而只扩增相应的敏感或抗药性基因。也可以将多个引物 在一个反应体系中进行（多重ASA），其产物通过毛细管电泳完成多个点突变的检测。等位基 因特异性扩增方法已成功用于检测大麦云纹斑病菌、马铃薯块茎斑点病菌、苹果黑星病菌、 日本梨黑星病菌、苹果褐腐病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性

11、;小麦白粉病菌、香蕉黑斑病 菌、黄瓜霜霉病菌、黄瓜白粉病菌、链格抱属等对甲氧丙烯酸酯类杀菌剂的抗药性。2.2.2 .等位基因特异性寡核苷酸杂交该方法的原理是利用人工合成的寡核苷酸片段(一般为19个碱基)作为探针与经PCR扩 增获得的靶DNA进行杂交，在严格控制杂交条件的前提下，通过斑点杂交检测，探针与靶DNA 片段之间只要有一个碱基不相互配对或错配，就能快速检出。2.2.3.实时定量PCR严格意义的实时定量PCR技术是指用SYBRGreen I荧光染料和荧光探针(如TaqMan探 针、分子信标)通过监测PCR过程(扩增效率)达到精确定量起始模板数的目的,同时以内参对 照有效排除假阴性结果。由于

12、荧光标记物与扩增产物结合后，被激发的荧光强度和扩增产物 成正比，在反应体系和反应条件完全相同时，样本含量应与扩增产物的对数成正比，故在一定 条件下荧光强度和样本含量成正比。根据PCR扩增呈指数增长的原理，实时定量PCR就是在 指数增长期根据荧光信号的变化实现对原始模板的准确定量。综上所述，运用现代分子生物学技术可以准确、灵敏的监测田间抗性菌株以及抗性群 体的发展动态，从而为合理的施用农药，提高药剂防治效果提供有效的参考数据。但是，如 果在病原菌群体中存在已知抗药性基因以外的抗药性机制时，采用分子检测的方法会过低估 计或评价抗药性病原群体的发展态势。3.前景展望植物病原真菌杀菌剂抗药性研究要充分

13、利用生物化学、遗传学、群体生物学等各学科 的综合知识，进一步加强交叉学科的分析研究，来全面研究抗药性发生与流行、抗药性机制、 抗性利用等等，最终为抗药性治理提供充分的依据。加强培育抗病品种、预测预报等综合防 治措施，对延缓抗药性的形成也是十分重要的。此外随着生物技术的发展，对植物病原菌抗 药性基因的利用已取得了初步的进展。我们要持续推动化学防治与生物防治的结合，加速综 合防治的发展。参考文献：张弛.番茄叶霉病菌对氟硅唑抗药性研究(硕士学位论文)D.沈阳：沈阳农业大学， 2004.2 徐作班、李林、于建垒等.蔬菜灰霉病菌对腐霉利抗药性变异及其治理.植物保护学报， 2001，25(1):33 一

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