中药复方抗纤抑癌方和复方鳖甲软肝片不同采血时间点药物血

1、高等学校博士学科点专项科研基金资助课题，课题编号：20060026010中药复方抗纤抑癌方和复方鳖甲软肝片不同采血时间点药物血清对HepG2肝癌细胞增殖活性的影响#赵志敏，叶永安，杨先照，甘大楠，马贺成，刘方北京中医药大学东直门医院，北京（100700）E-mail：kilorair摘要 目的 研究人来源不同采血时间点中药药物血清对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响。方法 HepG2人肝癌细胞体外培养，健康志愿者3名，服用中药复方抗纤抑癌方（KX）和中成药复方鳖甲软肝片（BJ）后不同时间点收集血清，采用MTT法检测各组药物血清对细胞增殖的影响。结果 1、1小时、2小时与MEM对照组比较，各实验

2、组药物血清对HepG2人肝癌细胞具有明显的增殖抑制作用（P0.01）；KX1小时20%浓度抑制效果优于KX2小时同浓度（P0.01）；KX1小时5%浓度与BJ1小时同浓度有差异（P0.05）；BJ2小时20%、10%浓度均较KX2小时抑制作用强（P0.05）。2、增加0.5小时抽血时间点，KX 0.5小时优于KX 2小时（P0.05）。3、与空白血清组比较，KX0.5小时40%浓度时抑制效果明显（P0.05）。结论 两种药物血清对HepG2人肝癌细胞均有增殖抑制作用；在同一采血时间点和不同时间点上，两种药物血清的抑制效果比较均存在差异。关键词 药物血清，采血时间点，HepG2细胞 Influe

3、nce of Kangxian yiai decoction and Fufang Biejia Ruangan Tablets on HepG2 cells on different blood sampling spotsZhimin Zhao, Yongan Ye, Xianzhao Yang, Danan Gan, Hecheng Ma, Fang Liu (Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing PRC 100700)AbstractObjective: To explore the inf

4、luence of different kinds of human-derived chinese medicine sera on proliferation of HepG2 cells on different blood sampling spots. Methods: HepG2 cells were cultured in vitro. The sera of 3 volunteers were collected before taking medicine as the control group, twice after taken medicine(Kangxian yi

5、ai decoction and Fufang Biejia Ruangan Tablets) 1 hour later and 2 hours again as the test group, MTT colorimetric assay was used to observe the influence on proliferation of HepG2 cells after incubate with different kinds of drugs containing serum. Results: 1 It showed that The inhibited proliferat

6、ion in test groups were better than that of control group（P0.01）. The inhibited proliferation of the concentration 20% of KX were better after 1hour than that of 2hours, and the difference had statistical significance. Compared with 5% KX group on the 1-hour blood sampling spot, the inhibited prolif

7、eration of the concentration 5% of BJ were better, and the difference had statistical significance(P0.05).While on the 2-hour blood sampling spot, the inhibited proliferation of different concentration of BJ were better than that of KX, the differences in BJ groups of 20% and 10% concentration had s

8、tatistical significance (P0.05). 2 In KX groups, the inhibited proliferation of different concentrations on HepG2 cells were better on the half-an-hour blood sampling spot than 2hour, and the difference had statistical significance (P0.05). 3 The inhibited proliferation of 40% concentration on the h

9、alf-an-hour blood sampling spot in KX group were better than that in control group, and the difference had statistical significance (P0.05).Conclusion: Both the two kinds of chinese herbal compound sera can inhibit the proliferation of HepG2 cells. The inhibited proliferation of different concentrat

10、ions on HepG2 cells were better on the half-an-hour blood sampling spot than 2 hour. It showed the trend that the inhibitory effects of the sera in BJ group on 2-hour blood sampling spot were better than 1 hour. The inhibitory effects of the two kinds of sera on different blood sampling spots or on

11、the same spot were different. Key Words: medicine serum; blood sampling spots; HepG2 cell line.0 引言药物血清因其方法学上的特点而使其在中医学的研究中具有一定的优势1，也是中医药研究的重要手段。目前研究采用人来源的药物血清日益增多，但是中药多是复方，成份复杂多样，多数中药人体药物代谢动力学不明，在不同时间点收集到的药物血清作用效果可能会存在差异。本实验我们选取叶永安教授临床治疗原发性肝癌较为有效的方剂复方抗纤抑癌方与中成药复方鳖甲软肝片制备人来源药物血清，采用MTT法检测不同抽血时间点、不同药物的药

12、物血清对HepG2细胞增殖是否存在差异。1 材料和方法1.1 材料人药物血清取自3名健康志愿者，男性，年龄2532岁之间，了解实验目的并签订知情同意书，服药前后各检查血尿便常规、肝肾功、心电图一次。药品：复方抗纤抑癌方：柴胡、黄芪、山药等。饮片购自东直门医院中药房。复方鳖甲软肝片：内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司生产，批准文号：国药准字Z19991011，0.5g/片，批号：20090322；细胞：HepG2人肝癌细胞，购自武汉中国典型培养物保藏中心，常规复苏、传代后，在37，5CO2条件下细胞培养箱内培养待用。试剂：噻唑兰（Sigma）购自北京优博奥生物技术有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购

13、自sigma公司；MEM培养基干粉购自GIBCO公司；胎牛血清购自HyClone公司；胰蛋白酶购自Solarbio。实验于北京中医药大学中医内科学重点实验室完成。1.2 方法1.2.1 含药血清制备志愿者在服药前空腹抽血一次，制备服药前空白对照血清；在服用复方抗纤抑癌方3天后，第4天晨起空腹服药后0.5小时、1小时、2小时各抽血一次，制备复方抗纤抑癌方药物血清；在服用复方鳖甲软肝片3天后，第4天晨起空腹服药后1小时、2小时抽血，每次8ml，室温静置半小时，离心分离血清（4000rmp,20min），56，30min灭活，分装，于-70保存备用。服用两种药物之间间隔1周作为洗脱期。1.2.2 分

14、组 我们先将1小时、2小时采集的复方抗纤抑癌方和复方鳖甲软肝片药物血清用无血清MEM培养基配成20%、10%、5%共3个浓度，同时设无血清MEM组为对照组，观察不同抽血时间点药物血清作用下的HepG2肝癌细胞生长状态。之后追加0.5小时采集的复方抗纤抑癌方药物血清与其自身1小时、2小时采血点比较，药物血清用无血清MEM培养基配成20%、10%、5%共3个浓度，同时设无血清MEM组为对照组。最后将0.5小时采集的复方抗纤抑癌方药物血清、2小时采集的复方鳖甲软肝片药物血清与服药前空白对照组血清进行比较，三种血清用无血清MEM培养基配成40%、20%、10%共3个浓度。1.2.3 细胞培养人肝癌细胞

15、HepG2培养于10%胎牛血清MEM培养液中，37，5CO2条件下培养，隔天换液，4-5天传代，待细胞接近长满时，用0.25%胰蛋白酶消化液消化传代。1.2.4 志愿者药物血清对HepG2人肝癌细胞增殖的影响采用MTT法检测。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1105ml-，接种于96孔板上，每孔100l。24h后将原培养液吸弃，换无血清MEM培养液，每孔100l，继续孵育。24h后将培养液吸弃，复方鳖甲软肝片组和抗纤抑癌方组分别加入含不同浓度药物血清的条件培养基，每孔100l。另设无血清MEM组（或服药前空白血清组）为对照，每组设3个复孔。分别培养24h后，将原培养液吸弃，换无血清MEM培养液

16、，每孔100l，再加入5mg/ml MTT每孔20l，孵育4小时，弃上清，每孔加DMSO 150l，震荡5min，充分溶解沉淀后，于酶联免疫检测仪492nm处检测吸光度数值（OD值）。1.2.5 统计学处理 实验数据用SPSS13.0软件处理。数据用Xs表示，计量资料的多组比较采用方差分析。2 结果2.1 1小时、2小时KX对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响（表1） KX各组与MEM组比较，均有统计学意义，说明无论1小时还是2小时抽血，KX各组对HepG2肝癌细胞均有明显的增殖抑制作用。整体来看，KX 1小时各血清浓度对HepG2肝癌细胞的抑制效果强于2小时，其中KX1小时20%浓度时，抑制

17、效果明显优于KX2小时20%浓度，有统计学意义。表1 不同时间点、不同浓度KX对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响组别血清浓度（%）OD值MEM00.5100.05 KX 1小时200.3440.03 *100.2960.02 *50.2530.03*KX 2小时200.3860.02*100.3210.03*50.2870.04*注：n=6；与MEM组比较，*P0.01；与KX 1小时20%浓度比较，P0.052.2 1小时、2小时复方鳖甲软肝片药物血清（BJ）对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响（表2） BJ各组与MEM组比较，均有统计学意义，说明无论1小时还是2小时抽血，BJ各组对Hep

18、G2肝癌细胞均有明显的增殖抑制作用。从数值上来看，存在BJ 2小时各血清浓度对HepG2肝癌细胞的增殖抑制效果高于1小时的趋势。表2 不同时间点、不同浓度BJ对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响组别血清浓度（%）OD值MEM00.4540.03BJ 1小时200.3280.02*100.3180.02*50.3040.03*BJ 2小时200.2970.03*100.2640.04*50.2590.06*注：n=6；与MEM组比较，*P0.012.3 服药后1小时采血，两种药物血清对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响（表3） 各治疗组与MEM组比较，均有统计学意义，说明两种药物血清对HepG2

19、肝癌细胞均有明显的增殖抑制作用。服药后1小时，KX在10%、5%浓度较BJ抑制作用强，其中5%浓度时有统计学意义。表3 服药后1小时KX、BJ对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响组别血清浓度（%）OD值MEM00.4820.05KX 1小时200.3440.03 *100.2960.02 *50.2530.03 *BJ 1小时200.3280.02 *100.3180.02 *50.3040.03 *注：n=6；与MEM组比较，*P0.01；与BJ 5%浓度比较，P0.052.4 服药后2小时采血，两种药物血清对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响（表4） 各治疗组与MEM组比较，均有统计学意义

20、，说明两种药物血清对HepG2肝癌细胞均有明显的增殖抑制作用。服药后2小时，BJ在3个浓度点上均较KX抑制作用强，其中20%、10%浓度时有统计学意义。表4 服药后2小时KX、BJ对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响组别血清浓度（%）OD值MEM00.4820.05KX 2小时200.3860.02 *100.3210.03 *50.2870.04 *BJ 2小时200.2970.03*100.2640.04 *50.2590.06 *注：n=6；与MEM组比较，*P0.01；与同浓度KX比较，P0.052.5 增加0.5小时抽血时间点后KX对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响（表5） KX各

21、组与MEM组比较，均有统计学意义，说明KX各组对HepG2肝癌细胞均有明显的增殖抑制作用。KX 0.5小时各浓度对HepG2肝癌细胞的抑制效果均明显高于2小时，有统计学意义。表5 不同时间点、不同浓度KX对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响组别血清浓度（%）OD值MEM00.5460.05KX 0.5小时200.3240.05*100.2720.03*50.2440.04*KX 1小时200.3420.03*100.2810.03*50.2580.03*KX 2小时200.3700.03*100.3070.03*50.2820.03*注：n=9；与MEM组比较，*P0.01；与KX 2小时相同

22、浓度组比较，P0.052.6 0.5小时的KX与2小时的BJ对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响（表6） 整体来看，KX 0.5小时各血清浓度对HepG2肝癌细胞的增殖抑制效果强于BJ2小时，其中KX0.5小时40%浓度时抑制效果明显，有统计学意义；BJ各组与同浓度服药前比较无统计学意义。表6 0.5小时的KX与2小时的BJ对HepG2人肝癌细胞增殖活性的影响（作用48小时）组别血清浓度（%）OD值服药前400.7490.16200.6900.13100.6230.13BJ 2小时400.6430.23200.6320.21100.6070.16KX 0.5小时400.5270.19*200.

23、5410.17100.5220.17注：n=9；与同浓度服药前组比较，*P0.05。3 讨论药物血清一直以来都是体外研究的重要手段之一，既往药物血清主要来源于动物，对实验动物药物血清的采血时间点也有专门的研究2。随着实验技术的发展，研究者逐渐意识到实验用材料的种属问题3，它包括两个层面的意义：一、种属一致 应该使用同种动物的药物血清作用于同种动物的细胞，避免与实验不相关的因素干扰实验结果；二、种属相近 目前体外实验多采用人来源的细胞，即应当采用最接近人体的实验条件，实验结果才能够最大限度的接近实际。但药物血清多数还是来源于动物，在人的细胞上添加动物血清作为刺激因素，存在不合理性。也有报道采集人血清进行药物血清实验，但也存在一定的问题，多数中药的药物代谢动力学不明，统一的采血时间点不能