医学专题醒脑开窍法在中风中的应用

1、醒脑开窍法在中风中的应用广州中医药大学第一附属医院吴智兵2021/7/20 星期二1醒脑开窍法在中风中的应用对醒脑开窍法的认识醒脑开窍法为什么可广泛应用于中风醒脑开窍代表药的实验研究2021/7/20 星期二2醒脑开窍法在中风中的应用对醒脑开窍法的认识醒脑开窍法为什么可广泛应用于中风醒脑开窍代表药的实验研究2021/7/20 星期二3醒脑开窍法在中风中的应用关于开窍法：是通过开闭通窍以苏醒神志的治疗方法分凉开和温开两大类2021/7/20 星期二4醒脑开窍法在中风中的应用具体方法：清热开窍安宫牛黄丸、紫雪丹、至宝丹温通开窍苏合香丸辟秽开窍行军散豁痰开窍菖蒲郁金汤通腑开窍大承气汤通瘀开窍通窍活血

2、汤2021/7/20 星期二5直接开窍法芳香开窍安宫牛黄丸苏合香丸君麝香.冰片芳香开窍醒神君麝香.冰片.苏合香.安息香芳香开窍醒神牛黄清热、化痰、定惊臣犀角.黄连.黄芩.栀子助牛黄清热臣木香.檀香.沉香.乳香.丁香.香附行气解郁辟秽散寒郁金助麝香开窍佐朱砂.珍珠.金箔安神佐荜茇.白术温中补气雄黄助牛黄解毒朱砂安神使蜂蜜和胃调中犀角、诃子反佐醒脑开窍法在中风中的应用2021/7/20 星期二6麝香（脐香，当门子，麝脐香）始载于神农本草经，被列为上品。本草求真：“辛温芳烈，开关利窍。无处不到，如邪气着人淹闭不起，则关窍闭塞，登时眼翻手握。僵仆昏地，故必用此辛香自内达外，则毫毛骨节俱开，而邪始从外出

3、”本草纲目：“盖麝香走窜，能通诸窍之不利，开经络壅遏。若诸风、诸气、诸血、诸痛、惊痫、癥瘕诸病，经络壅闭，孔窍不利者，安得不用为引导以开之、通之耶？”麝香2021/7/20 星期二7冰片（龙脑，梅片，龙脑香，梅花脑），为龙脑香料植物龙脑香树脂的加工品，始载于新修本草。味辛苦，微寒无毒，性善走窜，无往不达。本草纲目：“通诸窍，散郁火。” 本草衍义 “独行则势弱、佐使则有功”。冰片2021/7/20 星期二8醒脑开窍法在中风中的应用醒脑开窍法介绍醒脑开窍法为什么可广泛应用于中风醒脑开窍代表药的实验研究2021/7/20 星期二9中风病因病机积损正衰饮食不节情志所伤外邪入中病因风火痰虚瘀病机中风发病

4、中经络中脏腑闭证脱证2021/7/20 星期二10中风病因病机水瘀互结毒损脑络神窍闭阻中风病机新观点2021/7/20 星期二11意识产生的机制意识水平开关系统 特异上行投射系统（影响小） 非特异上行投射系统（影响大） 脑干网状上行激活系统 脑干网状上行抑制系统意识内容大脑皮层的高级活动 记忆、思维、定向、情感、精神、视、听、语言、技巧性运动、复杂反应2021/7/20 星期二12上行投射系统脑干上部网状结构效应区丘脑非特异性核团边缘系统旧皮质新大脑皮质被盖中央腹侧束被盖中央背侧束脑干网状结构联络区特异性上行投射系统下丘脑后区中央灰质脑干下部网状结构尾状核侧支红色：激活通路黑色：抑制通路202

5、1/7/20 星期二13中风病因病机风闭中风之后便无风，风过则凋敝狭义的闭窍仅指思维、意识、精神状态、认知能力等功能障碍。广义之“闭窍”则泛指由脑神受损所导致的一切外在生命活动的障碍，中风病无论有无神志障碍均可视为“窍闭神匿、神不导气”。病因之风、症状之风病机之风、病名之风2021/7/20 星期二14中风病因病机积损正衰饮食不节情志所伤外邪入中病因风火痰虚瘀病机中风发病中经络中脏腑闭证脱证脑窍闭阻2021/7/20 星期二15醒脑开窍法在中风中的应用为什么古代医家认为开窍方药不宜早用和久用？2021/7/20 星期二16醒脑开窍法在中风中的应用醒脑开窍法介绍醒脑开窍法为什么可广泛应用于中风醒

6、脑开窍代表药的实验研究2021/7/20 星期二17醒脑开窍法在中风中的应用麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠影响的实验研究国家自然科学基金项目（编号：300400580） 广东省科技厅项目（编号：2004B33001014）2021/7/20 星期二18一:麝香配伍冰片抗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的疗效观察大鼠神经功能障碍、脑梗死体积;脑组织含水量、BBB通透性;神经元超微结构的改变。实验研究二:麝香配伍冰片抗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的分子机制研究 麝香配伍冰片对脑缺血再灌注后脑水肿相关因子AQP-4 mRNA定量表达的影响 。麝香配伍冰片对脑缺血再灌注后炎症反应相关因子ICAM-1

7、 mRNA定量表达的影响 。2021/7/20 星期二19药物 麝香、冰片悬浊液（每毫升含人工麝香0.1mg，冰片0.3mg）， 用1%吐温80液配成；麝香悬浊液（每毫升含人工麝香0.1mg），用1%吐温80液配成； 冰片悬浊液（每毫升含冰片0.3mg）；用1%吐温80液配成；动物分组给药方法在造模前3天开始灌胃给药(10ml/kg/d)，每天两次，再于缺血前30min给药一次，缺血后12h与24h各给药一次假手术组模型组麝香配伍冰片组麝香组冰片组SD大鼠2021/7/20 星期二20一、神经功能缺损评分 Bederson氏6级评分标准, 主要通过观察动物的行为变化进行评分。 0分: 没有可见

8、的神经功能缺失； 1分: 左侧前爪不能伸直； 2分: 行走时断续向左侧倾斜划圈； 3分：向左侧持续转圈； 4分: 向左侧倾倒； 5分：不能行走。观察指标2021/7/20 星期二21二、脑梗死体积测定(TTC染色法)大鼠脑缺血2h再灌注24h后，麻醉后断头处死，迅速取出大鼠大脑;将大脑置0生理盐水中15min，再取出从额极间隔2mm连续做6个脑组织冠状切片;置2TTC溶液中，37水浴箱恒温孵育30min;置10%甲醛中固定24后，数码相机拍照，病理图像分析软件测量梗死灶面积，以梗死灶体积占全脑体积的百分率进行统计分析。观察指标2021/7/20 星期二22 假手术组 模型组 麝冰组结果:组别n

9、神经功能缺损评分相对脑梗死体积假手术组600模型组73.710.49 18.086.51 麝冰组72.140.69 8.964.85 麝香组62.830.75 12.196.7冰片组63.170.75 15.386.99 与模型组比较P0.01，与模型组比较P0.05 2021/7/20 星期二23实验三 麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑含水量及血脑屏障通透性影响 脑含水量 干湿重法测定BBB通透性（Evans-blue检测法）1、伊文思蓝甲酰胺标准曲线制备 将伊文思蓝5mg溶于10ml的甲酰 胺中,然后梯度稀释成不同浓度; 在紫外分光光度计上测定其吸光度， 测定波长为620nm，以浓度

10、(C)为 横坐标，以吸光度(A)为纵坐标， 求得回归方程: Y=0.0423X+0.0447 (Y为吸光度， X为浓度)2021/7/20 星期二242、BBB通透性实验方法：脑缺血2h 再灌注23h（处死前1小时），从大鼠股静脉注入2%Evansblue生理盐水液(3ml/kg);1小时后打开胸腔，用生理盐水经左心室灌注，将血管中的伊文思蓝冲洗干净，断头取脑。2021/7/20 星期二25取缺血侧大脑皮质，用滤纸吸干表面水分 ，精密称重，并置于含4ml二甲基甲酰胺的试管中，50孵育48h，再离心15min (3000r/min), 取上清液用Hitachi U2001分光光度计测定其吸光度

11、，并由标准曲线方程得出伊文思蓝的浓度（ug/g）。 2021/7/20 星期二26结果组别脑含水量（）EB含量（g/g脑组织）nn假手术组678.420.1960.520.73模型组681.510.53710.653.99麝冰组880.470.67*73.962.07*麝香组780.950.6267.275.62冰片组580.790.9364.871.83*与模型组比较P0.052021/7/20 星期二27实验四 麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经元超微结构影响 观察指标：神经元超微结构变化神经元突触超微结构变化2021/7/20 星期二28 假手术组 模型组 麝香配伍冰片组 神经细胞

12、双层核膜清晰易辨,核较大,核内染色质无凝聚现象，胞质内可见较多的内质网及核旁可见线粒体， 线粒体形态正常神经细胞缩小，胞膜、核膜模糊不清,核内染色质成团块状。 线粒体肿胀，粗面内质网扩张。神经细胞周围空隙明显增多；神经细胞双层核膜结构完整，染色质无凝聚现象，胞质内内质网扩张不明显，小部分线粒体肿胀1、神经元超微结构变化2021/7/20 星期二29 麝香组 冰片组神经细胞相对完整，核膜尚清楚，染色质分布均匀，胞质内内质网扩张，部分线粒体肿胀双层核膜结构尚完整，染色质分布尚均匀，胞质内可见内质网扩张，小部分线粒体肿胀2021/7/20 星期二30假手术组：神经细胞的轴突、树突与胶质细胞旁突相互交

13、织，连结形成神经毡，神经毡中突触数目众多，突触前、后膜致密物质厚度对称，前后界膜分界清楚，轮廓完整，突触小泡为圆形清亮小泡，大小均等，密集均匀分布于突触前终末内；模型组：神经毡内突触减少，结构模糊，前后界膜不清，突触小泡数量减少甚至消失，典型的突触结构已遭破坏。神经毡中轴浆电子密度降低，呈空化透明病变；麝香配伍冰片组：突触数量较模型组明显增多，但仍少于正常组，突触形态大部分接近正常，线粒体数量增多，仍有少数线粒体呈现肿胀病变，无轴浆空化表现；2、神经元突触变化2021/7/20 星期二31麝香组：与模型组相近似，轴浆空化明显，突触数量少，形态未恢复正常，线粒体数目稍有增多，部分线粒体形态接近；

14、冰片组：正常突触数量较模型组稍有增多，形态尚未恢复正常，线粒体数目增多，但肿胀仍存，轴浆空化病变基本消失；2021/7/20 星期二32突触数密度比较突触数密度比较组别n突触数密度假手术组526.252.4模型组59.303.55 麝冰组516.262.18 麝香组511.542.62冰片组512.642.68 与假手术组比较P0.01，与模型组比较P0.05 2021/7/20 星期二33实验五 麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠水通道蛋白4(AQP-4)mRNA表达影响 运用实时荧光定量PCR技术（Taqman探针法）定量检测 AQP-4 mRNA的表达 1、Taqman探针、引物设计与

15、合成 2、大鼠脑组织总RNA抽提 3、RT-PCR反应 4、PCR扩增 5、AQP-4 pMD 18-T载体的构建及标准品的制备 6、标准曲线的建立 7、Real Time PCR反应 2021/7/20 星期二34Taqman探针、引物设计与合成2021/7/20 星期二35标准曲线 各组样本荧光 扩增曲线 2021/7/20 星期二36结果 结果：组别n拷贝数/g总RNA假手术组62.451065.49105模型组66.371061.63106 麝冰组64.181061.45106 麝香组64.681061.49106冰片组64.241061.68106 与假手术组比较P0.01，与模型组比较P0.05 2021/7/20 星期二37实验六 麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠细胞间黏附分子1（ICAM-1）mRNA表达影响运用实时荧光定量PCR技术（Taqman探针法）定量检测 ICAM-1 mRNA的表达组别n拷贝数/g总RNA假手术组6135161900模型组65548310966 麝冰组6400835688 麝香组6452167221 冰片组6463008269与假手术组比较P0.01，与模型组比较P0.05、P0.012021/7/20 星期二38麝香配伍冰片可减少局灶性脑缺血再灌注大鼠脑