微生物学研究与应用技术

1、Module1：微生物学研究与应用技术一、PCR技术1、PCR原理：PCR技术是以DNA双链的复制和变性、复性为原理，在人工调控的温度下，提供DNA复制所需的引物、模板、dNTPs、聚合酶等条件，从而使得DNA可周而复始的进行复制扩增。2、PCR循环（步骤）：变性（denaturation）退火（annealing）延伸（extension）；变性：高温下，模板DNA发生热变性，双链解开成两条单链；退火：反应体系降温，使引物与模板DNA两端的碱基配对；延伸：DNA聚合酶使引物3端向前延伸合成新链；新合成的单链又可作为下一轮循环的模板进行复制，并不断重复上述的3个步骤，使得DNA片段呈指数增长，

2、在1h内可重复2530次，DNA的扩增量可达106107倍。3、PCR常用的耐热聚合酶：（1）TaqDNA聚合酶，耐高温但缺乏校正功能，使用最为广泛;（2）PfuDNA聚合酶、VentDNA聚合酶，既耐高温又具有校正功能的聚合酶；（3）TthDNA聚合酶，具有逆转录活性的聚合酶，可使RT-PCR在同一体系中进行，即使仅有极少量的RNA也可被扩增，可用于研究细胞RNA和RNA病毒。4、PCR的应用：（1）可用于基因的扩增和制备DNA探针，如已知目的基因两端的序列，利用PCR便可将其扩增出来，也可用于定位诱变和DNA测序；（2）可用于临床医学上检测传染病、诊断遗传病和分析癌基因；（3）在法医上可用

3、于进行亲子鉴定、个体鉴定等。5、PCR定位诱变技术（最常用）：任何基因只需要知道两端及需要的变异部位的序列即可进行PCR定位诱变。PCR诱变有两种方法：（1）基因末端诱变：5端或3端引物含有变异碱基，便可使PCR产物的末端引入变异。（2）基因中部诱变：在需要诱变的位置合成一对含有变异碱基的互补引物，然后分别于5端引物和3端引物进行PCR，这样便可得到两个含变异碱基的PCR产物，由于二者中间有一段序列彼此互补重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到变异的PCR产物。图P273二、革兰氏染色法基本原理方法：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞膜内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物（CVI）。革兰氏阳性菌

4、由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多和交联紧密，故遇乙醇处理时不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘的复合物牢牢地留在壁内，是其保持紫色。反之，革兰氏阴性菌因为细胞壁薄，外膜层的脂类含量高、肽聚糖层薄和交联度差，所以在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能截留结晶紫-碘复合物的溶出，因此，通过乙醇脱色后细胞退为无色。这时再经过沙黄等红色染料进行复染，只有革兰氏阴性菌会被染成红色。三、常用基因工程载体1、克隆载体：是指负责将外源基因运送到宿主细胞内进行复制与扩增的运输工具。2、作为克隆载体的要求：（1）载体应为一个独立的复制子，含有复制起始点且可在细胞内自主复制；（2）含有多克隆位点

5、，即含有若干限制酶单一切点，以便插入外源基因；（3）含有选择标记，便于对阳性克隆的筛选和鉴定；（4）具有一定的安全性，在胞内不发生重组和转移，在胞外也不能自由扩散。3、基因工程常用的5大载体：质粒载体、久噬菌体载体与黏粒载体、M13噬菌体载体与噬菌粒载体、真核生物克隆载体、人工染色体。4、主要克隆载体及其主要用途：一、细菌质粒载体一外源基因的克隆与表达，15kb；二、噬菌体载体一构建基因文库及cDNA文库，v23kb；三、黏粒载体（柯斯质粒载体）构建基因文库，49kb；四、M13噬菌体载体一单链DNA制备和测序、定位诱变、噬菌体展示，300400bp；五、噬菌粒载体外源基因的克隆与表达，10k

6、b；六、酵母质粒载体真核基因的克隆与表达，15kb；七、Ti质粒载体一植物基因工程载体，v20kb；八、酵母人工染色体（YAC）大基因簇相关功能基因研究、实现人类基因组计划和人类疾病相关基因研究、构建真核生物大片段基因文库，1002000kb；九、细菌人工染色体（BAC）同上，120300kb；5、载体对表达宿主的基本要求：（1）能够高效吸收外源DNA；（2）不具有限制修饰系统，不降解导入的未经修饰的外源DNA；（3）不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（recV）菌株；（4）根据载体类型选择相应宿主：如用久噬菌体或黏粒作为载体，须选择久噬菌体敏感的宿主（E.coli-K12）；选用M13时，

7、则应选择含有F因子的雄性大肠杆菌为宿主；（5）根据载体的标记选择合适的宿主，例如载体携带氨苄青霉素抗性基因作为选择标记，则应选择氨苄青霉素敏感菌株为宿主；（6）具有安全性，宿主细胞应该对人、畜、农作物无害。6、各种常见载体的特点特性：（1）质粒载体：含有复制起点；含有多种限制酶的单一识别位点；含有抗生素抗性基因的选择标记；高拷贝，每个细胞含有10200个拷贝的松弛型质粒；具有较小的相对分子质量，易于DNA的分离和操作；可通过转化或电穿孔法极易导入宿主细胞。（2）噬菌体载体：由两种类型，插入型（只含有一个单一限制位点，用于插入外源基因）和取代型（具有成对的限制酶切位点，外源基因可取代限制位点之间

8、的DNA）；优点有：可克隆大约23kb的外源基因，克隆能力大于质粒；感染宿主效率高达100%；不足之处在于，插入的外源基因的长度有限（需控制在野生型久DNA片段的78105%）,因为噬菌体头部可容纳的DNA量有限。（3）黏粒载体：由久噬菌体的COS位点和质粒DNA共同构建的；特点：克隆能力远超过质粒和噬菌体（本身57kb，克隆3548kb）；在宿主细胞内以质粒形式进行复制；由于可以搭载更大的DNA片段，所以可用于构建基因文库。（4）M13噬菌体载体：M13是大肠杆菌的丝状噬菌体，其基因组中除了基因间隔区（GI）外，其他均为复制和装配所需要的基因；所以其特点是：后期筛选阳性克隆便利（、在IG中插

9、入一段可以编码B-半乳糖苷酶的a肽基因，使其可与LacZ基因突变缺陷型的大肠杆菌互补生成具有活性的B-半乳糖苷酶。然后将M13和大肠杆菌涂布在含有IPTG和呈色物质X-gal的平板上，就会形成蓝色噬菌斑；2、如果在a肽编码区内插入限制酶切位点，当外源基因插入时，便会破坏a肽的互补作用，从而重组噬菌体就会形成白色噬菌斑。）；由于M13一般只能克隆300400bp的片段，所以常用于制备测序用的单链DNA、单链DNA探针和定位诱变模板，也可用于噬菌体展示（phagedisplay：将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，被展示的多肽或蛋白可保持

10、相对的空间结构和生物活性，展示在噬菌体的表面）（5）噬菌粒载体：由M13的基因间隔区（含复制起始位点）和质粒DNA共同构建的载体）其优点是：1、载体本身分子小（约3kb），易于遗传操作；2、可克隆10kb的外源基因片段，克隆能力高于M13；3、可用于制备单链或双链DNA。（真核生物克隆载体）（6）酵母质粒载体：多为为穿梭载体，可在酵母细胞中复制也可在细菌中复制；主要有3种类型：1、附加体质粒（可在酵母中复制，高拷贝）2、复制质粒（可在酵母中复制，中等拷贝）3、整合质粒（能整合到酵母染色体，不能自主复制，但可在细菌中自主复制）。（7）Ti质粒载体：为植物基因工程中的理想载体。（8）病毒载体：1、

11、哺乳动物病毒载体（高效识别宿主并将基因整合到宿主细胞中；高拷贝，强启动子）；2、昆虫动物病毒（优点：可克隆片段长可达100kb；咼表达；安全性咼）；3、植物病毒载体（植物基因工程载体）。（人工染色体）一大批量携带DNA的载体（9）酵母人工染色体（YAC）：一类目前能够携带最大量外源基因的载体；结构上有三个必备元件：着丝粒、端粒、自主复制序列（一般染色体所必需的）；本身只有10kb，但能携带1002000kb外源DNA片段。因此既保证所插入的外源基因片段结构完整，有可大大减小基因库所要求的克隆数。（10）细菌人工染色体（BAC）：可携带120300kb外源片段；特点：通常仅保留F因子的紧密型控制

12、的复制子，同时还含有多克隆位点和遗传标记；电穿孔法即可将其倒入宿主细菌中；不易发生重组，遗传性稳定，重组DNA也易于分离。四、纯培养获取技术1、whatisculture（培养物）：指在微生物学中在人为规定的条件下培养、繁殖获得的微生物群体；而只有一种微生物的培养物，称为纯培养物（pureculture）。2、主要可分为四类：（1）固体培养基获取法：以固化的培养基为微生物生长的承载体，然后通过：涂布平板法（将已熔化的培养基倒入无菌培养皿内制成无菌平板，待凝固后，将一定量的某一稀释度的样品的悬液滴加在平板表面，再用无菌涂布棒使菌液均匀地分散在平板表面，经培养后即可挑取到单个菌落。）；平板划线法（

13、用无菌接种环以无菌操作蘸取少量的分离材料（一般为涂布后培养所得），在无菌平板表面进行平行划线等连续划线形式，使接种环上微生物细胞数随着划线次数增加而减少，并逐步分散，如果划线适宜的话经培养后，可直接在平板上得到单一菌落。）；稀释到平板法（先将待分离的材料逐级进行10倍稀释，然后分别取不同稀释液少许与已熔化（约50C）的琼脂培养基混匀，后倒入无菌培养皿，凝固后即可得含菌琼脂平板，培养后可得到菌落。缺点：易使热敏感细菌死亡，也会阻碍一些严格好氧菌的生长）；稀释摇管法（用于分离严格厌氧菌株的稀释倒平板法；先将一系列盛有无菌琼脂培养基的试管加热，是琼脂熔化后保持50C左右，将待分离的材料用这些试管梯度

14、稀释后，迅速摇匀，冷凝后，在琼脂表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，隔绝空气。）（2）液体培养基获取法：通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法接种物在液体培养基中进行顺序稀释（较多平行稀释试管），已得到高度稀释效果，是一支试管分配不到一个微生物，如稀释后的试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物，其中得到纯培养物的稀释度的大多试管（95%）应是物微生物生长。缺点：只能分离出混杂微生物群体中的优势种群。（3）单细胞（孢子）分离法：材料经过一定稀释后在显微镜下用毛细管、显微针（环、钩）挑取单个细胞或孢子。（4）选择培养法：主要是根据目标微生物的生长代谢特点等

15、，制备或可抑制其他微生物的生长或极有利于该微生物生长的环境，从而经一段时间培养后使该微生物数量上升最后再采取涂布、划线的方法再进一步分离纯化。其方法有两种：选择平板培养基和富集培养（利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，使人们更容易在自然界中分离到该微生物）。五、基因的转移1、外源基因的导入方法（基因工程转基因方法）：（1）原核细胞的导入：通常可以通过转化、转染或感染等方式将外源基因导入原核细胞。转化：如果外源基因以重组质粒形式存在，可通过转化方式导入；转化基本程序：将一定浓度冰冷的CaCl2溶液处理对数期的大肠杆菌，然后加入外源DNA并在42

16、C下热休克处理90s,使感受态细胞吸收外源DNA。转染：外源基因以被构建成重组噬菌体DNA或重组噬菌粒，则以转染方式进入宿主细胞；（PS：无论转染还是转化，都要先使宿主细胞转变成感受态细胞，以便吸收外源基因）感染：将重组久噬菌体载体或重组黏粒载体，噬菌体各结构蛋白混合，包装成i噬菌体，然后去感染大肠杆菌。（效率高于转染）（2）真核细胞的导入：导入方法因宿主细胞不同而不同（酵母、哺乳动物、植物）酵母细胞：通常利用蜗牛酶去除酵母细胞壁，使其形成原生质体；再用氯化钙和聚乙二醇处理，使重组DNA以转化方式进入原生质体中；最后将转化后的原生质体置于再生培养基内培养是原生质体再生出细胞壁形成完整的酵母细胞

17、。哺乳动物细胞：较常用也最有效的方法一电穿孔法：将宿主细胞与重组DNA混合并置于电击槽中，在高压脉冲作用下（哺乳动物：2504000V/cm）,使细胞膜瞬时击穿形成微孔，进而重组DNA从微孔进入宿主细胞。（PS：哺乳动物细胞、植物细胞相对有效）方法二：利用病毒载体导入如把基因插入逆转录病毒载体中，然后将其感染靶细胞，这样就可以将RNA基因组的DNA拷贝整合到宿主细胞染色体中。植物细胞：除电穿孔法外，还有两种方法：1、根瘤土壤杆菌转化法：将含有重组Ti质粒的土壤杆菌与刚再生了细胞壁的植物原生质体共同培养或与植物叶片共同培养（缺点：仅适用双子叶植物）；2、基因枪法（微弹轰击法）：利用高压气体，将表

18、面吸附有外源DNA的金属微粒子高速射入植物细胞。（缺点：造价较贵）2、细菌的遗传转化：遗传转化（genetictransformation）是指同源或异源的游离DNA分子（质粒、染色体DNA）被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。自然转化：是细菌等微生物为适应自然环境，自发启动感受态化有关基因的表达，从而是自身处于感受态以吸收其他细菌释放的外源基因，从而增强自身的生存能力的一些列过程。（PS:自然感受态出现过程：细菌生长到一定阶段时会分泌一种小分子的蛋白质-感受态因子，这种感受态因子会与细胞表面对应的受体结合并作用，后诱导一些感受态特异蛋白的表达；其中一种为自溶素，它

19、的表达使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性。）研究表明，几乎所有的细菌都可以向环境中主动分泌（或细胞裂解释放）DNA，这些DNA分子可以与固型物（土粒、砂粒等）结合从而避免DNase的降解，以保持长时间的活性。另一方面，自然感受态作为许多细菌细胞应付不利生活条件的一种调节机制，在自然环境中存在具有普遍性，有实验表明，有些环境中感受态细胞在其群落中所占的比例可达16%。人工转化：是指在实验室中用多种不同的技术完成转化过程，包括CaCl2处理、电穿孔等。可为一些本身不具有自然转化能力的细菌（如大肠杆菌）提供了一条获取外源基因的途径，也是基因工程的基础技术之一。（m

20、ypoint:具有自然转化能力意味着有更加频繁的基因交流，从而不断改变对环境的适应能力，也就是说具有该能力的细菌多半是生存环境相对多变而不稳定。有关Ca导法：线性的细菌DNA较难转化，可能是线性DNA在进入细胞质之前就被周质空间内的DNA酶降解，而缺乏这种DNA酶的大肠杆菌可高效转化这种DNA。电穿孔法是一种真核、原核都适用的转化方法。3、转导（transduction）：是由病毒介导的细胞之间进行遗传交换的一种方式。具体是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒的感染转移到另一个细胞中。转导可分为两种：普遍性转导和局限性转导；其中：（1）普遍性转导，噬菌体可以转导体染色体的任何部分到受体细胞中；（

21、2）局限性转导，噬菌体只携带特定的片段到受体细胞中，与普遍性转导的区别在于1、被转导的基因共价地结合到噬菌体DNA上，2、携带特殊的染色体片段并将固定的个别基因导入受体中。温和噬菌体是局限性转导的典型代表。七、药物致癌性检测试验Ames试验：由加利福尼亚大学的Ames教授首先发明，该试验是利用鼠沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株的回复突变（指突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到回复的现象）性能来决定的。试验大致为：his-菌株在不含组氨酸的培养基尚不能生长，如果回复突变率因某种化学诱变剂（或待测样品）的作用而增加，则该药物可判断为具有致癌性（回复菌株数量越多则表示该物质诱变能力越强），为

22、了使体外试验更接近于人体代谢，Ames等采用了在体外加入哺乳动物微粒体酶系统，使待测物活化，从而使准确率可达80%90%。试验过程：1、在不含组氨酸的平板上接入组氨酸缺陷型沙门氏菌；2、在平板中心挖一个小孔，然后将待测物质放入小孔中（物质会向四周扩散，形成一个浓度梯度）；3、培养一段时间后，如果该物质有可致突变性，则该平板上会有菌落生长；如果没有菌落生长，则证明该物质不具致突变性。八、鞭毛检验试验方法一：在半固体（含0.3%0.4%琼脂）直立柱中用穿刺法接种某一细菌，经培养后，若刺穿线周围有呈浑浊的扩散区，则说明该细菌具有运动能力，并可推断其长有鞭毛；方法二：根据某细菌在平板培养基上的菌落外形

23、来判断，一般情况下，如果该细菌长出的菌落形状大、薄且不规则，边缘极不圆整，说明该细菌运动能力强；反之，若菌落外形圆整，边缘光滑、厚度较大，则说明该细菌为无鞭毛的细菌。九、无菌操作技术无菌技术（aseptictechnique）：在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染，且自身也不污染操作环境的技术。其中无菌技术可大致分成三个部分：（1）微生物培养常用器具无菌化（灭菌）：主要是将试管、玻璃烧瓶、培养皿等常用培养器具以及微生物培养基（可单独处理后加到无菌器具也可加到器具后一同处理）在使用前先行灭菌处理。常用的灭菌方式是高压蒸汽灭菌，一些玻璃、金属器具也可以用高温干热灭菌；此外，为了防止空

24、气中的杂菌污染，应在试管、烧瓶等加上可容空气流动但不能通过其他微生物的塞子（如硅胶塞、棉花塞等）；（2）无菌环境的建立：酒精灯火焰附近、无菌操作台（使用前先开启通风系统，并同时开启紫外线灯灭菌）、无菌室（主要通过无菌空气维持无菌状态，操作员进入前预处理）；（3）无菌操作：在动手进入无菌环境操作前，先用酒精消毒双手；然后如果是用接菌环转移微生物，则接菌前先将接菌环在酒精灯外炎灼烧，待冷却后后再操作；如果是转移液体培养物,则可利用无菌移液枪进行。（PS：培养基灭菌:一般培养基采用0.1013MPa,121.3C,1530min；含糖类的培养基常在0.56Kg/cm2,112.6C,1530min;

25、对于含糖类要求较高的培养基，可先将糖进行滤菌或间接除菌，再与其他已灭菌成分混合）（PS2:大多数实验室中称一个样品无菌，就是指在样品中找到活菌体的可能性不大于百万分之一）十、消毒与灭菌-微生物生长繁殖的控制消毒（disinfection），较大程度上减少物体表面或材料内部病原微生物的数量，使其无法引起疾病。灭菌（sterilization）杀死或除去材料中或物品上所有的微生物。微生物生长控制三规律:（1）微生物死亡呈对数速度，即在一定时间间隔内微生物以一定比例死亡；（2）微生物数量越少，灭菌所需的时间越短（尽可能做好灭菌前的预处理）；（3）不同微生物对不同抗微生物剂敏感度不同。根据消毒灭菌原理

26、不同可分为两大类:（1）化学物质控制法:1、抗微生物剂（antimicrobialagent），一类能够杀死或抑制微生物的化学物质，可以使天然产物也可是人工合成产物。一方面，根据抗微生物的特性可分为3类:1、抑菌剂:能抑制，但不能杀死细菌；2、杀菌剂:能杀死微生物，但不能使细胞溶解；3、溶菌剂:通过诱导细胞裂解来杀死微生物；另一方面，根据作用效果和作用范围可分为2类:1、消毒剂:通常用于非生物材料上微生物的杀灭（如仪器设备、墙壁地板、家具，水池等；空气常用甲醛、石碳酸、高锰酸钾等进行熏蒸）；2、防腐剂:具有杀死或抑制微生物生长的能力，但一般对于动物或人体组织无毒害作用（如0.11%硝酸银用于防

27、止新生儿眼部因淋病奈琴氏菌感染的致盲）。2、抗代谢物（antimetabolite），一类能够干扰微生物正常代谢从而使微生物生长受抑制的生长因子机构类似物（如磺胺类药物，是叶酸组成部分对氨基苯甲酸PAB）的结构类似物，磺胺类药物被微生物吸收后取代对氨基苯甲酸，干扰叶酸形成，抑制转甲基反应，从而导致微生物代谢絮乱。，3、抗生素（antibiotic），由某些生物合成的或半合成的一类次级代谢物或衍生物，具有抑制或杀死微生物的能力（主要通过抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞膜、作用于呼吸链以及干扰氧化磷酸化或抑制蛋白、核酸的合成来抑制或杀死微生物。，（2，物理因素控制法:1、高温灭菌法:包括高压蒸汽灭菌、

28、煮沸灭菌、间歇灭菌法灭菌、干热灭菌、灼烧等。（PS：衡量灭菌效果的指标：1、十倍减少时间（decimalreductiontime），即在一定的温度条件下杀死某一样品中90%微生物或抱子及芽抱所需的时间；2、热致死时间（thermaldeathtime），即在一定温度下杀死液体中所有微生物所需的时间。）高压蒸汽灭菌，一般实验室最常用的灭菌方法，常用采用0.1013MPa,121.3C,灭菌1530min；煮沸灭菌，将待消毒的材料置于水中煮沸15min或以上，如果在水中加入1%碳酸钠或2%5%石碳酸则杀菌效果更好；间歇灭菌法：即通过流通蒸汽或蒸煮反复灭菌，基本操作：第一次蒸煮后杀死微生物的营养体

29、，冷却过夜后，残留的芽孢会萌发；第二次蒸煮，便可将芽孢萌发后产生的营养体全部杀灭。这样反复23次，可以完全杀死样品中含有的芽孢，也可以保持某些营养物质不被破坏；干热灭菌：主要针对一些玻璃、金属器皿等耐热物品，但所需时间要比湿热灭菌长（如：170C需要1h，160C需要2h，121C需要16h）（PS2:巴斯德消毒法：1、瞬时法，71.6C至少15s（现在常用超高温瞬时法：140C5s）2、维持法：62.9C，维持30min,可杀灭大部分微生物。2、辐射灭菌法（radiationsterilization）：利用电辐射产生的电磁波来杀死微生物。如微波，通过热效应杀灭细菌；UV、X-ray、Y-r

30、ay等通过干扰或直接破坏大生物分子来达到杀灭微生物的效果。3、过滤法除菌：该方法主要针对空气和不耐热液体培养基等设计的方法，有三种类型：1、（最原始的）在一个容器的两层滤板间填充棉花、玻璃纤维。石棉等；2、膜滤器，由醋酸纤维素或硝酸纤维素制成的带微孔（0.220.45|Jm）的膜；3、核孔滤器，由核辐射处理的薄聚碳酸胶片（厚度10|Jm）再经过化学蚀刻而成（主要用于科学研究）。4、高渗作用：微生物生长对环境的渗透压也有一定要求，当外界渗透压高于或低于微生物胞内渗透压时，都会阻碍微生物的正常代谢甚至死亡，所以利用改变外界环境的渗透压也可达到控制微生物的效果（如食品腌制）。5、干燥作用：水是微生物

31、细胞的重要组成部分（占活细胞90%以上），降低物质的含水量直至干燥就可有效抑制微生物生长，防止腐败霉变等。6、超声波作用：超声波可产生的空穴效应，可将进入空穴区的微生物细胞裂解破碎。十一、营养缺陷型菌株分离营养缺陷型（auxotroph）,是一种缺乏合成其生存所必需的营养物质的突变型，只有从环境或培养基中获得这些营养物质或前体物才能生长。影印平板分离法（replicaplating）：（1）将待分离突变株的原始菌株以合适的稀释度涂布到野生型和突变型菌株都能生长的主平板a（完全培养基）上，经过培养后形成单菌落；（2）通过一个消毒的“印章”（直径略小于培养皿底，表面包有丝绒布）将a平板的菌落分别原

32、位转移（或印迹）到平板c（与a平板相同营养成分）和平板d（选择培养基，突变型无法生长）；（3）经过培养后对照观察平板c和d上形成的单菌落，如果在c上生长而d上不生长，则为所需的分离的突变型；（4）在c平板上挑取d平板上不能生长的相应位置的单菌落，并进一步在完全培养基上划线纯化。十二、病原体验证试验1、科赫定理4原则（：要证明某种微生物是引起某种疾病的致病因子所必须满足的4条原则）（1）在每一个病例中必须找到特异的病原体；（2）病原体必须能从患病宿主中分离得到，且能纯培养；（3）将纯培养的病原体接种到健康的易感宿主，能够引起同样的病症；（4）从接种后患病的实验宿主中必须能分离到与原始病原体相同的

33、病原体。（PS:科赫定理可以验证多数但不是所有的病原，因为有些病原体如梅毒密螺旋体很难培养,直到现在也未能人工培养；又有些除了人以外无其他宿主的微生物，除非有志愿者，否则无法接种易感宿主。）2、验证方法之科赫定理验证法：（a）从感染动物体内分离疑似病原体微生物，然后进行纯培养；（b）将分离并纯培养后的微生物注射到易感健康的实验宿主体内；（c）如果动物患病（可能死亡），分离其体内的疑似病原微生物，并纯培养；（d）比对两次分离得到的纯培养物，如果相同则证明所提取的微生物为该疾病的病原体。十三、菌株鉴定常规鉴定大致的步骤（以细菌为例）：（1）首先要掌握菌株的一些基本特征，如细胞的形态、革兰氏染色结果

34、、以及其他突出的形态学特征；（2）了解其营养类型、需氧性等突出生理生化特征；（3）在前边的基础上查阅分类（鉴定）手册或有关资料，确定该菌株属于哪一大类，然后利用资料中有关该类群的分类检索表或特征比较表格等资料中所提供的鉴别特征进行进一步的特征测定；（4）在根据测定结果查对检索表或有关特征描述，逐步缩小菌株的归属范围，初步确定菌株所归属的科、属；（5）如果要鉴定到种，则需要进一步查阅相关属的分种检索表或相关分种的鉴别特征资料。进一步地鉴定，最后初步确定其归属的种。鉴定方案2：（1）对鉴定样品进行检查，看是否需要进一步纯化；（2）测定该菌株的一些最基本的形态和生理生化特征，然后根据微生物分类鉴定手

35、册等有关资料，确定该菌株属于哪一大类；（3）根据待测菌株所属的类群，进行16rRNA或18SrRNA基因序列测定，从而可以得知该菌株与相关数据库中已知微生物的相似性，进而初步确定其分类地位；（4）进一步检测该菌株的表型特征、生理生化特征以及相关化学组分，必要时进行管家基因序列等分析；（5）综合前边的检测结果，确定菌株的分类地位。十四、微生物的保藏技术1、传代培养保藏（短期）采用传代培养保藏微生物应注意针对不同菌种选择适宜的培养基，并在规定时间内进行转移；在琼脂斜面上保藏微生物因菌种的不同，保藏的时间也会不同，一般来说通过降低被保藏微生物的代谢水平或防止培养基干燥可以延长传代保藏保存的时间。（如

36、：在菌株生长良好时，改用橡皮塞密封或在培养基上覆盖上一层石蜡，并且降低保藏温度；）（PS：悬液保藏法：将一些菌苔直接刮入蒸馏水或缓冲液中，密封置于4C保藏。常用方法：琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养基。缺点：长期传代操作繁琐、容易放生污染，菌株容易放生突变而产生衰退。2、冷冻保藏微生物处于冷冻状态时，其代谢作用也会停止，可达到保藏的目的。注意事项1：进行冷冻时，应适当采用速冻的方法，可避免产生大冰晶从而损伤细胞；同时，升温时也应采用快速升温的方式，可避免因升温而使冰晶增长产生对细胞的伤害；注意事项2：冷冻时的介质也会对细胞产生损伤，因此，像冷冻前加入甘油或二甲亚枫可降低细胞强烈的脱水作用来保护

37、细胞，所以一般冷冻保藏时都需要加入保护剂来提高保藏物的存活率。注意事项3：一般推荐（加了甘油保护剂）在-70C低温冰箱保存，如条件不足，在-20-30C普通冰箱保存是应注意避免因冰箱温度变化引起的培养物的反复冻融而造成的细胞损伤。3、干燥保藏法（最普遍、有效）常见的干燥保藏技术：沙土管保存和冷冻真空保藏。沙土管保存，主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等；一般过程：（1）将菌种接种到斜面，培养至长出大量孢子；（2）洗下孢子制成孢子悬液；（3）然后加入无菌的沙土管中，减压干燥直至将水分抽干；（4）最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置于冰箱。冷冻真空保藏，是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻

38、结后，在真空状态下通过冰的升华作用去除水分；干燥后的样品可以在真空或惰性气体的密闭环境中低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧、低温的状态下进入休眠，进而可长时间地进行保藏。卜五、培养基（cUturemedium）1、配制原则：选择适合的营养物质：一般而言，培养基都应含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水和能源。但由于微生物营养类型复杂，对营养物质要求也不一样，因此配制培养基时，应首先针对所培养的微生物的营养类型来配制针对性强的培养基。一般常用的3种培养基：（1）牛肉膏蛋白胨培养基，常用于培养细菌；（2）高氏一号培养基，用于培养放线菌；（3）查氏培养基，用于培养霉菌；（PS:酵母菌常用麦芽汁培养基

39、）；适宜的营养浓度及配比：培养基中营养物质浓度合适时微生物才能良好生长，浓度过低不能满足微生物正常代谢生长，过高则会抑制生长。另外培养基中各营养物质的之间浓度配比也会影响微生物的生长代谢，其中尤其是碳氮比。PH控制：一般而言，细菌和放线菌适于PH775范围内生长；酵母菌和霉菌适合在PH456范围内生长；然而由于微生物在生长繁殖过程中的新陈代谢会使的培养基的PH产生变化，所以通常会在培养基中加入磷酸氢二钾或磷酸二氢钾混合而成的缓冲剂，以控制PH。控制氧化还原电位：不同微生物生长对氧化还原电位的要求不一样，一般好氧菌值在0.1V以上能正常生长（0.30.4V为宜），厌氧菌只能在低于0.1V条件下生

40、长，兼性厌氧菌在值为0.1V可进行有氧呼吸，0.1V以下进行发酵；控制方法：在PH值稳定情况下，提高氧分或加入氧化剂可增加值；在培养基中加入抗坏血酸、半胱氨酸等还原性物质可降低值。原料选择：尽可能利用廉价且易于获得的原料作为培养基成分，特别是在发酵工业中。灭菌处理：要获得纯培养物，就必须避免杂菌污染，因此需要对使用器材、工作场所和配制好的培养基进行消毒灭菌。培养基常用高温高压灭菌处理，工作场所常定期使用福尔马林进行熏蒸。2、几种培养基：（1）基础培养基：含有一般微生物生长繁殖所需要的基本营养物质的培养基；可满足大部分微生物的最基本生长需求（如：牛肉膏蛋白胨培养基）；（2）加富培养基，也称营养培

41、养基即在基础培养基中加入某些特殊的营养物质制成的类营养丰富的培养基（特殊营养物质：如血液、血清、酵母浸粉、动物组织液等），常用于培养营养要求严苛的异养微生物（如百日咳德氏菌）；（PS：加富培养基与选择培养基区别：加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量，使其形成生长优势从而得到分离；而选择培养基一般是抑制不需要的微生物的生长，从而使所需要的微生物增殖。）（3）鉴别培养基，用于鉴别不同类型微生物的培养基。原理：通过加入某种特殊的化学物质，从而使目标微生物在培养基生长后能产生某种代谢物，而这种代谢物可以与培养基中的特殊化学物质发生特殊的化学反应，产生明显的特征性变化，进而就可将该微生物与其他微生

42、物区分开来。（PS:主要用于快速分类鉴定以及分离和筛选菌种）（4）选择培养基，用来将特定的微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基；其原理是在培养基中加入特定的化学物质或特殊营养物质，抑制不需要的微生物生长，来增加所需微生物的生长繁殖。（5）其他几种培养基：a分析培养基，常用来分析某些化学物质的浓度也可用于分析微生物的营养需求；b还原性培养基，专门用来培养厌氧型微生物；c组织培养物培养基，含有动植物细胞，用来培养病毒、衣原体、立克次氏体等专性活细胞寄生的微生物。3、培养技术的突破与发展：进展一、在培养基中加入一些非传统的生长底物促进新型微生物的生长，并发现一些新生理型的微生物。（如从海底沉积

43、物中分离出一种以有毒亚磷酸作为电子供体，硫酸作为受体的新型化学能无机自养微生物Desulfotignu）；进展二、采用营养成分缺乏的培养基营养浓度是正常的1%（如以补充磷酸盐、铵盐和有机碳源的海水为培养基，研究发现了北美西海岸的浮游细菌（SAR11）的生态分布和确定其进化的分类地位）；进展三、采用新颖的培养方法，模拟天然环境，以流动式供应营养液，使不同微生物细胞间可以进行细胞交流，实现细胞互喂（cross-feeding），促进菌落形成。方法有：细胞微囊法和扩散小室法。十六、显微镜与显微技术根据显微镜的成像原理可将当前所使用的显微镜分为3类：光学显微镜、电子显微镜和探针扫面显微镜。（1）光学显

44、微镜。1、明视野显微镜，原理：光纤投射照明，物象处于亮背景中。2、暗视野显微镜，通过特殊的聚光器实现斜射照明，亮物象形成于暗背景中（。应用：不易被染色或染色易破坏样本结构的观察-如梅毒密螺旋体；观察活细胞运动）3、相差显微镜，通过特殊的聚光器和物镜将通过样品不同部位产生的光波相位差转变为振幅差（明暗差异），以提高样品不同部位间的反差。（应用于活细胞及其内部结构的观察）4、荧光显微镜，经过荧光染料染色或荧光抗体处理的样品在紫外线等短波长光照射下激发出长波光的可见光，在暗背景中形成明亮的彩色物象。5、激光共聚焦显微镜，以激光作为光源，每次照明样品的一个点，连续扫描后经计算机处理获得样品二维或三维图

45、像，对工作环境和技术操作要求较高。（应用：对完整细胞的细微立体结构进行观察和分析）（2）电子显微镜。1、透射电镜，用电子束作为“光源”聚焦成像，分辨率较光学显微镜大大提高，但设备庞大、造价高昂，样品观察需要真空环境。（用于观察病毒等颗粒微小的样品的形态特征或通过超薄切片观察细胞内部结构）2、扫描电镜，电子束在样品表面进行扫描，收集样品表面被激发形成的二次电子形成的物象。（一般用于观察样品表面的立体结构）（3）探针扫描显微镜。（此类显微镜相比电子显微镜，能提供更高分辨率，且可在生理状态下对生物大分子或细胞结构进行观察，对观察环境要求相对较低，且仪器体积小，价格也相对便宜）1、隧道扫描显微镜，用细

46、小的探针在样品表面进行扫描，通过记录针尖和样品间隧道效应电流的变化形成物象。2、原子力显微镜，利用细小探针对样品表面进行恒定高度扫描，同时通过一个激光装置来监测探针随样品表面的升降变化来获得样品表面形貌信息。十八、同步培养技术（synchronousculture）同步培养，是一种使微生物群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞的培养方法；同步生长，以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式。同步培养主要可归纳为两大类：机械法和环境条件控制技术。1、机械法：常用的有三种：（1）离心法（质量），将不同步的细胞悬浮在不被这种细菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液

47、中，通过密度梯度离心将不同细胞分布呈不同细胞带，每一细胞带大致都是出于同一生长阶段，分别将其取出进行培养便可获得同步细胞；（2）过滤分离法（大小）：将不同步的细胞培养物通过孔径大小不同的微孔过滤器，从而将大小不同的细胞分开，然后分别将滤液中的细胞取出进行培养，就可获得同步细胞；（3）硝酸纤维素滤膜法（粘附性），其原理是根据细菌能紧紧地结合到硝酸纤维素滤膜上的特点，将细菌悬液通过垫有硝酸纤维素滤膜的过滤器，然后将滤膜颠倒过来，在让培养基流过滤器，以洗去未结合的细菌，这时新分裂的细菌被洗下来，分步收集并通过培养即可获得同步细胞。2、环境条件控制法：这类技术是根据细菌生长与分裂对环境因子要求不同的原

48、理设计的一类同步细胞的方法。主要有：（1）温度控制法：通过适宜与不适宜的温度来回交替处理后，通过培养便可获得同步细胞；（2）培养基成分控制法：培养基中的碳、氮源或生长因子不足时，可导致细菌缓慢生长直至停止。因此，方法一（饥饿法）：将不同步的细菌在营养不足条件下培养一段时间，然后再转移到营养丰富的培养基中培养；方法二（抑制法）：将不同步细胞转接到含有一定浓度的，能抑制蛋白质等生物大分子合成的化学物质（如抗生素等）的培养基中培养一段时间，再转接到完全培养基里培养。十九、微生物生长测定技术微生物生长测定，可以用来客观评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响，或评价不同的抗菌物质对微生物产的作用效果

49、，或客观反映微生物的生长规律。测定方法有：计数法、重量法和生理指标法等。1、计数法，此类方法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。其中又可分为：（1）直接计数法，利用特定的血球计数板或细菌计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中的微生物数量；缺点：不能区分活、死细胞；计算公式：每毫升原液细菌数=每小格平均细菌数*400*1000*稀释倍数。（2）间接计数法，又称活菌计数法，原理：每个活细菌在适宜的培养条件下可以通过生长形成单一的菌落；常用方法：将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择3个稀释度的菌液，分别取0.2ml放入无菌培养皿中，在倒入适量的已熔化并降温至45C左右的培

50、养基，混匀、冷却凝固后放入是以环境中培养，长出菌落后计数；公式：每毫升原液活菌数=同一稀释度3个以上重复培养皿菌落平均数*稀释倍数*5；缺点：易于因人为失误而造成污染或结果不稳定和测定丝状体微生物。（3）比浊法，原理：在一定范围内，细菌的悬液中细胞浓度和浑浊度呈正比，即细菌数量越多，光密度越大。方法：借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度（opticaldensity-OD）表示菌量。2、重量法，是根据每个细胞都有一定的重量而设计的，用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。方法（鲜干重）：将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经过洗涤，再离心后直接称重，求出湿重（如果是

51、丝状微生物，过滤后用滤纸吸干是水分再称重）；然后将样品装入已知重量的培养皿等容器中，在105C下烘干至恒重，后在干燥器中冷却，称量干重。（PS：如果测定长在培养基上的丝状真菌、放线菌，可将培养基缓慢加热到50C熔化琼脂，再过滤得到菌丝体，然后用生理盐水洗涤）；（PS2：凯氏定氮法一总含氮量与蛋白质总量间的关系换算公式:蛋白质总量=含氮量*6.25；细胞总量=蛋白质总量/65%约等于总蛋白质量*1.54）3、生理指标法，生理指标包括微生物的呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等，样品中生物数量越多或生长越旺盛，这些指标越明显，因此借助特定仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等来测定。（主要用来分析微生物的

52、生理活动）二十、病毒研究的基本方法主要有：病毒的分离与纯化、病毒定量测定、病毒的鉴定三大类。1、病毒的分离与纯化：（1）分离病毒的分离是将疑有病毒而待分离的标本经过处理后，接种于敏感宿主、鸡胚或细胞中培养，经过一段时间孵育后，通过检查病毒特异性感染表现或用其他方法来肯定病毒存在的研究方法。主要过程：（a）标本釆集与处理：原则，应确保用于分离的样本应含有足够量的活病毒；所以采集策略：根据所需采集标本的种类，确定采集时间和标本处理方法；此外，一方面为了避免细菌污染，标本一般都应该加入抗生素除菌（或用过滤、离心），另一方面，为了使病毒充分释放且保持活性，在研磨或超声波处理后应该立即接种（若需保存或运

53、送，数小时内可置于50%中性甘油内4C保存，较长时间则需-20C或干冰保存）；（b）标本接种与感染表现：接种策略，标本接种于何种实验宿主（鸡胚、细菌、动物细胞等），以及选择何种接种途径主要取决于病毒宿主的范围和组织嗜性，同时应该考虑操作简单、易于培养、所产生的感染结果容易判断等要求。（例如：噬菌体细菌培养物，液体培养基-浑浊变清澈，琼脂平板-噬菌斑；嗜神经病毒脑内接种；嗜呼吸道病毒鼻腔接种、鸡胚尿囊等）（PS：由于组织培养生长的细胞对病毒敏感性较体内成熟细胞高，同时体外也没有免疫系统干扰，操作相对简便，所以目前多数动物病毒都利用离体细胞来培养）。感染表现：显微镜观察现象大多数动物病毒感染敏感细

54、胞培养物都能引起细胞产生病变效应（cytopathiceffect，CPE），如细胞聚集成团、肿大、圆缩或形成合胞体、出现包涵体，乃至细胞裂解等现象；所以接种于细胞培养的标本主要以细胞病变作为病毒感染指标。肉眼观察现象标本进过适当稀释在进行接种并辅以染色处理，病毒便可在单层细胞上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑（Plaque）。（2）病毒纯化制备纯净的病毒材料而尽可能除去其他杂质的过程。1、两大纯化标准：（a）纯化的病毒制备物必须保持病毒原有的感染性；（b）纯化病毒制备物的毒力大小、形态、密度、化学组成及抗原特性应当具有均一性表现，并可利用超速离心、电泳、电镜或免疫学技术进行检查。2、常用纯

55、化方法：第一，利用蛋白质提纯的方法来纯化病毒（病毒的主要成分是蛋白质）故可以使用盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析及离子交换层析等；第二，超速离心纯化，因为病毒颗粒有一定的大小、形状和密度,，一般可以在10000100000g的离心场中沉淀12小时。（广泛用于病毒纯化）2、病毒感染性测定（assayofinfectivity）病毒的感染性测定，是指对有感染性病毒颗粒数量的测定；感染性测定所测得的都不是感染性病毒颗粒的绝对数量，而是能引起宿主或细胞一定特异性反应的病毒最小剂量，即感染单位（IU）；病毒的效价（滴度）：每毫升病毒悬液所含的感染单位数目（IU/ml）。测定方法：（a）蚀斑测定法

56、（最先是为测定噬菌体感染性所建立的）：原理：病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。1、噬菌体检测：一般釆用琼脂叠层法，即以一定量的经过系列稀释的噬菌体悬液分别于高浓度的敏感细菌悬液以及半固体营养琼脂均匀混合后，涂布在已铺有较高浓度的营养琼脂平板上，经过孵育后在延伸成片的菌苔上可出现分散的单个噬菌斑。因为噬菌斑的数目与加入样品的有感染性的噬菌体颗粒数量呈正比，统计噬菌斑数目后可计算出噬菌体悬液的

57、效价，并以菌落形成单位(PFU)/mL表示；2、动物病毒检测：其噬菌斑的测定方法与噬菌体的噬菌斑计数方法类似，不同在于动物病毒是以生长在固定支持物上的单层细胞代替了菌苔，由于动物病毒在单层细胞上所产生的蚀斑表现不同，所以有空斑测定、合胞体计数、转化灶测定和吸附蚀斑测定等不同方式，但最终的病毒效价都以蚀斑形成单位PFU表示。3、植物病毒：坏死斑测定(枯斑测定)，用金刚砂之类的能破坏植物表皮与细胞壁的粉末状物质与一定量的植物病毒混合摩擦植物叶片进行接种，以产生的坏死斑的数目来测定病毒效价。(PS：病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/m1)来表示。例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58,接种量为0

58、.2m1,病毒的稀释度为2.5X103,则病毒原液的滴度为：580.2X2.5X103=7.25X105(PFU/ml)(PS2:技术应用：蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。)(b)终点法(针对不能形成蚀斑或或坏死斑的动植物病毒)操作方法：1、取等体积的进过10倍或2倍稀释的病毒系列稀释液分别接种同样的实验单元；2、经过一致时间孵育后，试验单元群体中的半数(50%)个体出现某一感染反应所对应的病毒剂量确定为病毒样品的效价(半数效应剂量)，以对应的病毒稀释度的倒数的对数值表示。半数效应剂量类型：(1)半数致死剂量LD50

59、；(2)半数感染剂量一ID50；(3)半数组织培养感染剂量一tcid50。3、病毒的鉴定根据病毒感染宿主范围及感染表现鉴定，大多数病毒都有相当专一的宿主范围，因而病毒的宿主谱可作为病毒初步鉴定的指标；病毒的理化性质鉴定，利用电镜技术、超速离心技术等可检查毒粒大小、形态和结构特征，测定病毒及其组分的沉降系数、浮力密度和相对分子质量，鉴定病毒的核酸类型；以及紫外线、化学药剂和脂溶剂等理化因子对病毒感染性作用，确定病毒的对不同理化因子的敏感性。血细胞凝集性质鉴定，许多病毒能吸附于一定种类的哺乳动物剧或禽类的血细胞表面产生凝集现象，而且不同的病毒所凝集的血细胞的种类以及发生凝集所要求的温度、PH条件可

60、能不同，这些性质给病毒鉴定提供了重要的依据。免疫学鉴定，建立在抗原-抗体特异性反应基础上的免疫学方法是一类常见且重要的病毒鉴定方法，主要技术有：免疫沉淀反应、凝集反应、酶联免疫反应、血凝抑制实验、中和实验、免疫荧光、免疫电32镜以及单克隆抗体等。PS：利用病毒的性质来检测抗原-抗体反应的方法：血凝抑制实验和中和实验。血凝抑制实验，是根据特异性的病毒抗体和病毒表面有凝血活性的蛋白质结合，可抑制病毒血细胞凝集反应发生的原理而设计的；中和实验，是建立在病毒中和作用的基础上，即某些特异性病毒抗体与病毒颗粒作用，能够使病毒失去感染能力从而阻止了病毒的繁殖的原理设计的。分子生物学方法，可运用聚丙烯酰氨凝胶