基因敲除与高表达、细胞培养技术

1、基因高表达利用高表达质粒载体pCaEXP通过基因同源重组方法构建SODs基因高 表达的VX2瘤株肝癌模型。一、材料、试剂和仪器高表达质粒载体pCaEXP，大肠杆菌，培养基（按配方配制酵母浸膏 蛋白月东葡萄糖培养基），限制性内切酶；Pyrobest DNA olymerase、 DNA Marker DL2000、Goldview核酸染料，质粒DNA小量抽提试剂 盒、PCR产物纯化试剂盒，琼脂糖，小量酵母菌总R NA抽提试剂盒， Real Time RT-PCR 所用试剂；Real Time PCR仪，FR-200紫外与可见分析装置，电泳槽，高 速冷冻离心机，恒温振荡培养箱。二、方法步骤为了实现

2、SODs基因的高表达，将SODs基因完整开放阅读框（ORF） 连接于高表达质粒载体pCaEXP中MET3启动子的后面，以实现MET3 对SODs基因ORF的控制。1、首先用基因组抽提试剂盒抽提SODs基因组，在SODs基因组中用含 有Bam H I和Pst I酶切位点的引物P1和P2扩增SODs基因ORF全长。2、使用上述两个酶分别酶切SODs基因的ORF和pCaEXP质粒，酶切 产物纯化后使用T4 DNA ligase进行连接。将连接产物转化感受态 大肠杆菌DH5a，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上进行筛选，挑取 阳性克隆扩增后采用质粒抽提试剂盒小量抽提质粒，然后对所抽提 的高表达质粒载体p

3、CaEXP-SPE 1采用酶切方法进行鉴定。基因敲除基因敲除兔肝癌模型制备，方法有很多种，如传统ES打靶、 TALEN、CRISPR/Cas9，还有 TetraOneTM 基因敲除。以 CRISPR/Cas9 技术为例：一、材料、试剂和仪器sgRNA; UCA试剂盒（对sgRNA/Cas9进行活性检测），质粒载体， sgRNA/Cas9 mRNA，PCR试剂盒，其他常规试剂；全自动生化分析仪，微量移液器，电热恒温水浴箱，超净工作台， 凝胶图像扫描仪，微波炉，混匀器，离心机，生物显微镜。二、方法步骤EGE技术（基于Crispr cas9技术）设计构建识别靶序列的sgRNA;设计构建致靶基因切割的

4、EGE系统载体质粒；利用UCA试剂盒对sgRNA/Cas9进行活性检测；设计构建打靶载体；体外转录 sgRNA/Cas9 mRNA;兔肝癌原核注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶载体；获得Fo代兔，利用PCR对Fo代兔进行基因型鉴定；获得F1代兔，利用PCR和southern blot杂交技术对F1代兔进 行基因型鉴定。细胞培养一、材料、试剂和仪器 主要仪器与试剂匀胶机，光刻机，体视显微镜，倒置荧光显微镜，等离子键合机， 酶标仪，图像处理软件，CO培养箱，水浴锅，灌流泵，大容量离心 机，超净工作台，移液器等；海藻酸钠，氯化钙，柠檬酸钠，荧光素钠，胰蛋白酶，小牛血清， RPMI-1640培养

5、基，胰蛋白酶，L-谷氨酰胺SU-8光刻胶及显影液， Sylgard184型聚二甲基硅氧烷，染色剂，以及青霉素与链霉素。二、方法步骤HBSS 溶液：取 HBSS 47. 5 m L,分别加入 0. 5 mol / L EGTA0. 05 m L和1 mol / L HEPES2. 5 m L,充分均匀,4C保存备用。SFM培养液：取RPMI-1640培养基45 m L,分别加入50以g / m L 青链霉素0. 5 m L,10 mg /m L链霉素0. 25 m L,灭活小牛血清5 m L,200 mmol/L L-谷氨酰胺0. 5 m L,充分混匀备用。将细胞接种于培养皿中37C,5% CO2培养箱