实验室常规实验方案

1、TSS法制备NEB Ecoli2566、2984大肠杆菌感受态细胞1. TSS 溶液配制（100mL）：10gPEG8000或PEG6000 （10%, wt/vol ）5mLDMSO（5%，vol/vol）1.0165gMgCl2 - 6H2O （50mM）加入18培养基溶解以上化合物并混匀，调节pH到65，之后，用LB培养基定容 至U100mL。之后，将配制的TSS溶液高温高压灭菌，之后，分装到1.5mL离心管 中，-20C长期保存。注意事项：必须调pH至6.5，否则高温高压灭菌后，容易产生Mg （OH） 2沉淀造 成TSS溶液中Mg2+降低，这会对后面的实验造成不利影响；TSS溶液灭菌后

2、最好分装到小离心管中，放入-20C保存，因为其在4C冰箱中很 容易长菌。2. TSS法制备大肠杆菌感受态细胞（NEB 2566/2984）涂5保存的菌液到LB平板（无抗生素）上，37C倒平板过夜培养；挑一个单克隆菌落到5mL LB液体培养基（无抗生素）中，37C，220rpm振荡培养过 夜；按1:100的比例吸取1mL过夜培养的菌液到100mL新鲜LB液体培养基中，37C，220rpm 条件下对其进行扩大培养，至菌液的OD600到0.4-06之间；在超净工作台中将菌液收集到50mL或100mL离心管中，冰浴10min，此时应提前打开 冷冻离心机预冷；设置冷冻离心机参数为4C， 1000 xg，

3、 10min，离心收集菌体；离心完毕后，在超净工作台中倒尽上清液，用4mL预冷的TSS溶液悬浮菌体，将混匀 的菌液以100p L/管分装到灭菌的1.5mL离心管中，迅速投入液氮中速冻，实验完毕后， 将感受态细胞放入-70C冰箱长期保存。注意事项：第一步活化菌种涂平板时，不易涂过多的菌液，否则，不易分离到单克隆菌 落；扩大培养时，要准确把握菌液的od600的变化，此步是感受态制备效果好坏的关键。不 同菌株制备感受态细胞对OD600的要求不同，NEB 2566菌株在0.4-05之间较好，而 2984菌株则在05-0.6之间较好，要达到此要求，两种菌种需扩大培养2h30min左右（以 1:100的比

4、例扩大培养）；100mL扩大培养的菌液离心后收集的菌体约需4mL TSS溶液重悬，可制备约40管感受 态细胞；分装前，用移液枪轻轻地悬浮菌体，待悬浮均匀后再进行分装，否则，会造成同一批感 受态效果有明显的差异。低温CaCl2法制备Origami B (DE3)菌株感受态细胞涂 5L 保存的 Origami B (DE3)菌液到 LB 平板(含 12.5口 g/mL Tet和 15口 g/mL Kan)上，37C倒平板过夜培养；挑一个单克隆菌落到5mL LB液体培养基(含12.5口 g/mL Tet和15口 g/mL Kan)中，37C, 220rpm振荡培养过夜；按1:100的比例吸取1mL过

5、夜培养的菌液到100mL新鲜LB液体培养基(含12.5口 g/mL Tet 和15M g/mL Kan)中，37C, 220rpm条件下扩大培养2h30min,至菌液的OD600到04-06 之间；在超净工作台中将菌液收集到50mL或100mL离心管中，冰浴10min，此时应提前打开冷 冻离心机预冷；4C，1000 &，离心10min，弃尽上清，加10ml预冷的0.1M CaCl2到离心管中，用移液枪轻 轻混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟；4C，1000 g离心10min，弃尽上清，加2ml预冷的0.1M的CaCl2+ 2mL预冷的30%灭菌甘 油，重悬浮菌体，混匀。每管分装0.1ml，迅速投入液

6、氮中速冻，待实验完毕后，保存于-70C 低温冰箱中。注意事项：因为Origami B (DE3)菌株本身含有Tet、Kan两种抗性，其菌株特性的维持依 赖于这两种抗性，因此，Origami B (DE3)菌株的活化、扩大培养等过程中均需要加ATet. Kan两种抗生素；收集菌体后，感受态制备的整个过程中要保持低温操作，所用的各种试剂均需要预冷，这对 所制备感受态细胞的转化效率高低很重要；四环素(Tet)储液用无水乙醇配制，浓度最好配成5mg/ml，因为四环素在乙醇中不易溶解。Ecoli感受态细胞的转化操作提前打开42 C水浴锅；-70C冰箱中取出分装的感受态细胞，置于冰中，待感受态细胞刚刚解冻

7、时，用 移液枪加入0.5M l质粒或者10m L连接反应混合液，用枪头轻轻搅拌混匀，然后 冰浴；冰浴30min后，将转化混合液置于42C水浴锅中热激30s，之后，迅速取出并放 入冰中静置5min；吸取100m L菌液到LB平板培养基上，用消过毒的涂布棒涂布均匀，之后，放 置于超净工作台中吹干平板；置于37C培养箱中倒平板过夜培养。注意事项：最好是在感受态细胞刚刚解冻时加入质粒或者是连接反应混合物；NEB 2984和Origami B (DE3)感受态细胞的最佳热激时间是30s；如果遇到转化效率过低或者转化后不长单克隆的情况，可以进行进行复苏培养提高转化效 率。复苏培养的具体操作如下：在热激并冰

8、上静置5min后，可往菌液中加入900m L液体LB 或者SOC培养基，之后将菌液置于37C、250皿摇床振荡培养1h，常温低速离心收集菌 体，弃900m L上清液，将剩余的100m L菌液混匀并涂平板。NEB给出的数据复苏培养时间最好为1h，每减少15min，则转化效率降低两倍；250rpm振 荡培养比不振荡培养转化效率提高两倍；复苏培养可以选用LB培养基，但SOC培养基可 以大大提高转化效率。NEB T4噬菌体DNA连接酶使用方法反应体系如下表所示：成分20 l反应体系10X T4 DNA Ligase 缓冲液2 pl载体(3 kb)50 ng (0.025 pmol)插入片段(1 kb)50 ng (0.076 pmol)Nuclease-free waterto 20 plT4 DNA Ligase1 pl按表中反应体系的标准加入各种试剂、底物、ddH2O，用移液枪轻轻混匀；16C过夜或者室温10min；冰上冷却，之后，吸取2-105反应产物加入1005感受态细胞中。注意事项：从图中可以看出，205反应体系中推荐用的载体、插入片段的摩尔数分别为0025 Pmol、0076 pmol，载体和插入片段的摩尔比为1:3,实际操作中可根据实验需要加 大插入片段的用量，其范围最好在1：31:6之间。具体实验中，20 m l反应体系中所用的载体、插入片段的摩尔数是已知的，但是， 所