木薯粉酒精发酵实验报告篇

1、-. z实验报告实验目的掌握木薯分酒精发酵的根本过程与主要参数的测定方法。 熟悉根本仪器的工作原理和使用方法二、实验原理酒精发酵是在厌氧条件下，己糖分解为乙醇并释放出二氧化碳。酒精发酵的类型有3种：即通过EMP途径的酵母菌酒精发酵、通过HMP途径的细菌酒精发酵和通过ED途径的细菌酒精发酵酵母菌通过EMP途径分解己糖生成丙酮酸，在厌氧条件和微酸性下，丙酮酸则继续分解为乙醇。淀粉类原料的酒精发酵主要有先糖化后发酵工艺和边糖化变发酵工艺即同步糖化发酵工艺2种，前者发酵时间长、酒精浓度低；后者发酵时间短，酒精浓度高，而且由于没有终产物抑制，糖化酶用量也较少，因此该工艺是酒精发酵研究的重要方向之一。本实

2、验即采用的是同步糖化发酵工艺。液化酶即-淀粉酶，可将淀粉液化成糊精及少量麦芽糖和葡萄糖。糖化酶是一种淀粉外切酶，能把淀粉从非复原性未端水解a-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非复原末端释放-D-葡萄糖。三、实验材料1、菌种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeGGSF162、培养基斜面菌种保藏培养基：葡萄糖20g/L,酵母浸膏10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂20g/L，加水溶解，自然pH，于121下蒸汽灭菌30min。一级种子培养基：葡萄糖20g/L,酵母浸膏10g/L，蛋白胨20g/L，自然pH，于121

3、下蒸汽灭菌30min。二级种子培养基：葡萄糖20g/L,酵母浸膏10g/L，蛋白胨20g/L，pH值自然，于121下蒸汽灭菌30min。发酵培养基：量取初始全渣总糖浓度291.48g/L和滤液总糖浓度295.57g/L的木薯粉浆液ml，接种前参加用过滤膜过滤的尿素溶液，添加量为3.0g/L。3、主要仪器标准筛40目、立式压力蒸汽灭菌器、低速台式大容量离心机、全温度恒温调速摇瓶柜、台式冷冻离心机、生物传感分析仪SBA-40C、分光光度计、酸度计、漩涡混合器、Motic数码生物镜、灭菌锅、3000ml三角瓶2个、500ml三角瓶11个、万用电炉、0.5-10ul移液枪、100-1000ul移液枪、

4、1000-5000ul移液枪、酸式滴定管25ml。4、溶液及试剂菲林甲液CuSO45H2O：称取69.3g CuSO45H2O，参加蒸馏水定容至1000ml；菲林乙液：C4O6H4KNa：称取346.0g C4O6H4KNa和100.0gNaOH，参加蒸馏水定容至1000ml；2.5g/L的标准葡萄糖溶液：称取在102左右条件下，烘烤4h的葡萄糖2.5g准确至0.0002g参加蒸馏水定容至1000ml，12h之后可以使用；2mol/LHCl溶液：浓盐酸5.6mL，定容至100mL容量瓶中；质量分数为20%的HCl溶液：浓盐酸514mL，参加蒸馏水定容至1000mL容量瓶中；200g/LNaOH

5、溶液：称取200g氢氧化钠，参加蒸馏水定容于1000mL容量瓶中；2mol/L NaOH溶液：称取8g氢氧化钠，参加蒸馏水定容于100mL容量瓶中；3g/L尿素：称取3g尿素，参加蒸馏水定容于1000mL容量瓶中；2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液：用电子分析天平准确称取次甲基蓝和二水合柠檬酸三钠分别为10mg和2g，用蒸馏水溶解并定容至100ml。四、实验步骤称取过40目筛或80目筛枯燥的木薯粉1453g，以料水比1：2的比例参加2906g60的蒸馏水，按10U/g木薯粉的量参加40000U/ml液化酶400uL，搅拌混匀后于60下保温30min并不停搅拌。转入灭菌锅中迅速升温到95，保温液化1

6、h，期间不停搅拌，尽量不要让木薯粉浓醪中的固体颗粒粘连于容器壁上。然后降温至50-60，取10ml全渣液备用测总糖，将液化后的全渣液过滤，制的滤液测总糖。根据测得滤液的总糖浓度调滤液的总糖浓度至270g/L，于121下灭菌30min，然后冷却至33左右。按250U/g木薯粉的量参加100000U的糖化酶。按接种量为10接种酿酒酵母GGSF16至液化糖化后的醪液中，同时参加3g/L尿素，分别取样10mL置于两个三角瓶中用于测定初总糖和初复原糖。余下的分装到10三角瓶，每瓶约300ml，分别接上发酵栓，并于33发酵，转速为160r/min，摇床培养72h，期间每隔6h取样分析。发酵完毕后，测定细胞

7、数、OD值、总糖含量、复原糖含量、酒精度、葡萄糖含量。木薯粉酒精发酵工艺流程图如下-. z木薯粉过筛称重调浆升温液化降温全渣液化液滤液过滤测总糖调总糖灭菌降温接种10%摇瓶发酵过程取样分析总糖复原糖酒精葡萄糖OD值1453g液化酶400ul加水2906g95 1h270g/L/121 30min33尿素3g/L糖化酶250u/mL300ml/瓶(5-6)瓶 33 160r/min细胞数50-60 6 12 18 2436 36 42 4656 60 66 72 单位:h图4-1木薯粉酒精发酵工艺流程图Fig.4-1 the process flow diagram of cassawa sta

8、rch ethanol fermentation-. z五、实验检测方法1、测总糖(1)原理本次试验采用的测总糖的方法是斐林试剂法，因此直接滴定前需要在试样参加盐酸并在加热条件下使试样中非复原糖局部酸解为复原性糖。菲林试剂是由甲、乙两种溶液组成。甲液含质量分数为0.05 g/mL的硫酸铜和次甲基蓝(氧化复原指示剂)；乙液含质量分数为0.1 g/mL的氢氧化钠，酒石酸钠。将一定量的碱性酒石酸铜甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反响，生成氢氧化铜沉淀所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反响，生成可溶性的酒石酸钾钠铜。在加热条件下，用样液滴定，样液中的复原糖与酒石酸钾钠铜反响，酒石酸钾钠铜被复原糖复

9、原，产生红色氧化亚铜沉淀，复原糖则被氧化和降解。反响生成的氧化亚铜沉淀。滴定时以亚甲基蓝为氧化复原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被复原后，稍过量的复原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝复原为无色的复原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出复原糖含量。(2)步骤试样制备称取10mL过滤液试样于250mL三角瓶中，加70mL蒸馏水和20mL质量分数为20%的HCl溶液，沸水浴中水解60min，冰水迅速冷却，以200g/L的NaOH溶液中和到微酸性pH为5-6之间，参加蒸馏水定容到250mL，振荡摇匀，倒入离心管中，以4000r/min的转速离心10min，取滤液备用。斐林

10、试剂所消耗葡萄糖标准溶液的体积标定A. 预备试验： 吸取斐林甲液、乙液及标准葡萄糖液各5mL于250mL三角瓶，加20mL蒸馏水，摇匀，在电炉上加热，从沸腾开场计时约2min，参加亚甲基蓝溶液2滴，在沸腾状态下1min用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失为止。记录标准葡萄糖液消耗的总体积。B. 正式试验：吸取斐林甲液、乙液及标准葡萄糖液各5mL于250mL三角瓶，加蒸馏水20mL，滴入少于预备试验1毫升的2.5g/L的标准葡萄糖溶液，置电炉上沸腾2min，滴入亚甲基蓝2滴，沸腾状态下1min以标准葡萄糖溶液滴定，至溶液蓝色刚好消失。记录标准葡萄糖液消耗的总体积，并做平行试验，使两次滴定结果之差在0.1

11、mL之。试样总糖的测定A.预备试验： 吸取斐林甲液、乙液及待测液各5mL于250mL三角瓶，加20mL蒸馏水，摇匀，在电炉上加热沸腾，2min后参加亚甲基蓝溶液2滴，在沸腾状态下1min用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失为止。记录标准葡萄糖液消耗的总体积。B.正式试验：吸取斐林甲液、乙液及待测液各5mL于250mL三角瓶，加蒸馏水20mL，参加少于预备试验1毫升的2.5g/L标准葡萄糖溶液，置电炉上沸腾2min，滴入亚甲基兰2滴，沸腾状态下1min以标准葡萄糖溶液滴定，至溶液蓝色刚好消失为止。记录标准葡萄糖液消耗的总体积，并做平行试验，使两次滴定结果之差在0.1mL之。(3)计算公式总糖含量以葡萄糖

12、计，g/L=A-B0.0025250EQ F(1,5)EQ EQ EQ F(1,10) 式中：A标定10ml菲林试剂所消耗的标准葡萄糖溶液的体积，mL；B往10ml菲林试剂中参加5ml水解后试样消耗标准葡萄糖溶液的体积，mL；5定糖时，用移液管吸取5ml试样水解液的体积，mL；2.5实验前配制好的标准葡萄糖溶液的浓度，g/L；250试样水解液的定容体积，mL；10取木薯粉浆液化滤液的体积，mL2、测复原糖本实验仍然采用斐林试剂法测定过滤液中的复原糖，因此不需要对过滤液进展酸解，原理与计算方法如上1 试样的制备称取糖化醪试样10mL加蒸馏水定容至250mL，振荡摇匀，倒入离心管中，以4000r/

13、min的转速离心10min，取滤液备用。2试样复原糖的测定预备试验：同总糖的测定。正式试验：同总糖的测定。3、细胞数(1)原理：用血球计数板在在显微镜下直接技术是一种常用的微生物技术方法，本次试验采用的是三目生物显微镜，可以将显微镜观测到的细胞成像在电脑上，方便计数，提高效率。血球计数板是一块特质的厚玻璃，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网分有九个大方格，中间的大方格是计数室，计数室的规格有两种，本次试验采用的是25个中方格，每个中方格有16个小方格，其中位于正中及四个角的中方格是细胞计数区域，计数室由400个方格组成，面积

14、为1mm2,每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。(2)步骤:1.将离心管的过滤液稀释至容易计数的浓度，一般一个小方格510个细胞为宜。如将12h的过滤液试样稀释10倍是用移液枪取100ul试样放入装有900ul蒸馏水的离心管中，然后将离心管放在振荡器振荡1min。混合均匀后取100ul稀释后试样与100ul美兰再次混合即稀释至20倍。2.取干净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。将稀释好的过滤液摇匀，用移液枪吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽沿盖玻片的下边缘摘入一小滴不宜

15、过多，让稀释液利用液体的外表力充满计数区，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余液体，注意不能有气泡产生。3.静置片刻，使酵母细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。在计数前假设发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。4.找到计数室后按如下列图所示数字与箭头顺序用电脑拍下每个中方格图片尽量拍下完整的中方格。图片拍完后，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒保存。125435.数图片中的酵母细胞数：在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有

16、统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。对于出芽的酵母菌，芽体到达母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2-3次每次数值不应相差过大，否则应重新操作。(3)计算公式25格16格的血球计数板计算公式：细胞数/ml=80小格细胞个数/8040010000稀释倍数即1:500004、OD值本次使用的仪器是分光光度计sh55001 样品的制备翻开仪器电源，将分光光度计预热0.5h，准备好待测样品，翻开仪器软件。2 蒸馏水在600nm波长下吸光度的测定用

17、无菌枪头吸取少量蒸馏水，滴一滴约2ul在下检镜孔，盖上上臂，保持5s，然后用擦镜纸擦拭上下检镜孔，重复清洗一次。用10ul移液枪吸取2ul的蒸馏水滴在下检镜孔，盖上臂。单击计算机的Black再按Measure键或鼠标左键，读取600nm波长下，蒸馏水的吸光度。3 样品在600nm波长下吸光度的测定先清洗上下检镜孔，用无菌枪头取振荡混合均匀的待测菌悬液2ul，同上述方法，读取改菌悬液在600nm波长下的吸光度；重复此操作并记录实验数据。测下一个样品前需清洗上下检镜孔，同上。5、葡萄糖(1)实验仪器和原理本次实验测葡萄糖所用的仪器是SBA-40C型生物传感分析仪。SBA-40C型生物传感分析仪是以

18、固定化酶为关键元件，由微电脑控制双指标智能化仪表。SBA40C型系列生物传感双功能分析仪利用酶促反响来定量，样品分析工作原理如下：固定化酶底物 O2 H2O 产物 H2O2或葡萄糖葡萄糖氧化酶葡萄糖酸 H2O2或乙醇乙醇氧化酶乙酸 H2O2样品经稀释后要求pH在68左右，由定量进样针吸取25ul，并注入反响池，含有样品的底物在样品室迅速按照一定比例混合均匀，底物透过酶膜圈的外层与固定化酶层接触并反响，反响放出的H2O2再透过酶膜圈的层与白金银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与底物浓度成线性比例关系，经微机控制的信号，可直接显示并打印结果。(2)实验根本步骤取1ml发酵过程样品，9000r/

19、min离心5min，取上清液稀释至适宜浓度，取稀释过的溶液25ul用生物传感仪分析测定葡萄糖浓度生物传感仪预先用1g/L葡萄糖标准溶液标定，并记录相关数据。(3)葡萄糖含量计算公式葡萄糖含量(g/L)=C0.01稀释倍数 试中：C生物传感仪读数，mg/dL 0.01单位换算系统6、酒精度用100ml量筒准确量取样液100mL，并称取100mL样液的质量，用100ml水洗涤进入500mL蒸馏烧瓶中，再往蒸馏烧瓶中参加5mL1mol/LNaOH溶液，加热蒸馏，馏出液收集于100mL的容量瓶中，带馏出液接近刻度时取下，加水至刻度，摇匀，然后倒入100mL干净枯燥的量筒中，以酒精计和温度计同时测酒精度

20、和温度，根据测出的酒精度和温度，换算为20的酒度(%,v/v)。附表 酒精度与温度校正表溶液温度/酒精计示值5.56.06.57.07.58.08.59.0温度20时用容积百分数表示的酒浓度205.56.06.57.07.58.08.59.0215.45.86.36.87.37.88.38.8225.25.76.26.77.27.78.28.6235.05.56.06.57.07.58.08.4244.95.45.86.36.87.37.88.3254.75.25.76.26.67.17.68.1264.55.05.56.06.46.97.47.9274.34.85.35.86.36.77.2

21、7.7284.24.65.15.66.16.57.07.5294.04.44.95.45.86.36.87.2303.84.24.75.15.66.16.67.0六、实验过程记录10:00 筛粉10:30 称重10:35 调浆11:00 加液化酶，混和均匀并于60下保温30min并不停搅拌1130 液化，灭菌锅中，温度为95，时间为60min12:30 冷却降温至6013:30过滤14:00分装于三角瓶中15:00测初总糖20:00调总糖 大于270g/L20:30开场灭菌种子摇床培养32,24 h12:0012:00 接种13:30第1次取样13:30开场摇床培养33、160r/min19:30第2 次取样01:30第3次取样07:30第4次取样13:30第5次取样19:30第6次取样01:30第7次取样07:30