引物步移法测序

1、引物步移法测序复制网址新浪微博豆瓣社区腾讯微博开心网人人网只看楼主听说长片段（500）测序一般采用所谓引物步移”的方法，根据测序结果设计引物继续walking，直至测 通全长。那么根据测序结果设计一个引物，另一端用什么引物？是用随机引物吗？如果用随机引物的话， 这组随机引物怎么设计？各位高手有没有这方面的资料可以看看，先谢谢了0票票数good good study day day up flameofstar edited on 2006-08-20 13:57 举报【专题讨论】将支气管镜操作进行到底。热烈欢迎上海长海医院呼吸内科黄海东主治医师做客 丁香园。xrsgjt2006-11-13 1

2、4:14 消息 引用 收藏分享测序引物只要一条就可以了啊。为什么需要两条呢？呵呵。只要在你巳有的结果上设计一条引物往积分0得票0粉丝加关注下走就可以了，一般的测序公司都可以做到。若是片断太长你可以重两头同时开始测序这样省时些。有什么问题发邮件到 HYPERLINK mailto:xiong_ xiong_ 继续探讨Re:请问什么是步移法步移法一般认为是由于反向PCR可用于研究与已知DNA片段相连的未知染色体序列，因 此又被称为染色体步移法。此法所选择的引物虽与已知DNA序列互补，但两引物3端是反 向的。染色体步移技术主要应用于克隆启动子、步查获得新物种中基因的非保守区域、鉴定 T-DNA或转座

3、子的插入位点、染色体测序工作中的空隙填补，从而获得完整的基因组序列 等方面。screen.width-333)this.width=screen.width-333 width=640 height=404title=Click to view full 染色体步移法 1.JPG (700 X 442) border=0align=absmiddle克隆步移法作者：agui674 提交日期：2007-1-22 16:22:00在基因组测序中，存在着两种不同的战略，即全基因组随机测序战略和以物理图为基 础的以大片断克隆为单位的定向测序战略。两者的最大区别在于是否依赖基因组作图。全基因组随机测序战

4、略主要采用鸟枪法(shotgun)。鸟枪法，也俗称“霰弹法”，是随 机先将整个基因组打碎成小片段进行测序，最终利用计算机根据序列之间的重叠关系进行排 序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。“鸟枪法”优点是速度快，简单易行，成本较 低，可以在较短的时间内通过集中机器和人力的方法获得大量的基因片断。但是用它来测序， 最终排序结果的拼接组装比较困难，尤其在部分重复序列较高的地方难度较大。此外有许多 序列片段难以定位在确切的染色体上，成为游离片断；同时又会有许多地方由于没有足够的 覆盖率而形成空缺。这些缺陷最终导致整个基因图会留下大量的空洞（gap），也影响其准确 度。以大片断以定位的克隆为基础的

5、定向测序战略主要采用克隆步移法或称克隆连克隆法 （clone by clone）：先构建遗传图，再利用几套高度覆盖的大片段基因组文库（BAC、PAC等） 获得精细的物理图，选择合适的BAC或PAC克隆测序，利用计算机拼装。BAC内的空洞 基本上都可以利用设计引物等手段填补，形成一条完整的BAC序列。然后由相互关联、部 分重叠的BAC克隆连成一个大的重叠群（Contig）。理想状况下，整条染色体就是由一个完 整的重叠群构成。但通常情况下部分BAC之间会有物理空洞（Physical Gap），这是目前国 际上还未克服的难题。利用克隆步移法测序，国际上通行的标准要求BAC测序达到十倍覆 盖率，使所测

6、的序列达到99.99%以上的准确度。该方法的技术难度较高，尤其大片段基因 组文库（BAC）和精细物理图构建是技术性极强的工作；此外，费用相对于鸟枪法要稍高 一些，完成整个基因组测序周期也要长些。但是，通过这种方法得到的基因组数据是最为准 确和精细的数据，也是基因组测序的最终目标。大基因组“完成图”目前大多都是通过这种方 法获得的。基因组“完成图”，即完全覆盖所测物种的基因组、准确率超过99.99%的全DNA序列 图。“完成图”的覆盖率接近100%，准确率更高，达到99.99%。“完成图”将为人们提供更 详尽、更准确的基因图谱。草图与完成图是测定水稻基因组序列的两个阶段，草图绘制的是 整个基因组

7、的框架，完成图则是基因组序列测定的完成结果和最终目标。【求助/交流】染色体步移的方法获取基因全长序列，测序结果不对，是什么原因?作者:pcc163 （站内联系 TA）收录:2010-06-07发布:2010-05-26染色体步移的方法获取基因全长序列，引物设计和模板都没问题，PCR结果显示有一条清 晰的条带，但测序结果不对，是什么原因？大家帮忙想想是怎么回事，谢谢了linxi8579 （站内联系 TA）你说的就是walking吧，我也正在做呢。前段时间我也出现这样的情况，后来我又重新做的。 原因可能是测序有问题，或者在PCR时模板是混杂的染色体，有可能别的搭在了正确的序 列上恰好被扩增了。我们

8、当初分析了这两个原因，总之还是要重做的吧。希望有同行能够推 翻我的解释啊。2585165 （站内联系TA）是用PCR产物直接测得序么？还是连接之后测得？biosafety （站内联系 TA）walking会产生一些非特异性的扩增，建议在已知的一端设计一对扩增片段短的鉴定引物， 先对walking产物进行验证后再测序。测序还是克隆到载体上较好，用上面所说的引物再鉴 定一下，测序结果就没问题了。PCR产物直接测序，一是引物位置附近序列无法获得，其 次是如果模板不纯，效果不好。zsxnd （站内联系TA）Originally posted by biosafety at 2010-05-27 0621:walking会产生一些非特异性的扩增，建议在已知的一端设计一对扩增片段短的鉴定引物， 先对walking产物进行验证后再测序。测序还是克隆到载体上较好，用上面所说的引物再鉴 定一下，测序结果就没问题了。PCR产物直接.I think so ！liuxn0103 （站内联系 TA）我们也再做，也出现过这样结果。除了上面提到可能原因。我们认为还有一个原因：你的模 板质量很重要。顺祝试验顺利！linxi8579 （站内联系 TA）Originally posted by pcc163 at 2010-05-26 2