CRRTPCR引物克隆表达的全套解决方案

1、PCR和RT-PCR基础PCR基础聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷

2、酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响表1. 反应成分ComponentFinal ConcentrationTemplate104-106 copies of DNA templatePrimer 1MPrimer 2M10X Reaction buffer1XMagnesium1.0-3.0mMdNTP mix200 mM each dNTPThermostable DNA polymerase1-4 units/100

3、 ml reactionRT-PCR基础RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT

4、-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行这本指南阐述了成功RT-PCR和PCR的关键。高灵敏性（从小量样品中得到足量结果）和高特异性（选择性地仅得到所需的产物）是成功PCR的标志。可以通过仔细的实验设计（如选择恰当的酶，设计最理想的引物，使用不同的缓冲液和添加剂，确定循环参数及制备高质量的模板等）以获得最佳的RT-PCR和PCR。增加RT-PCR灵敏度分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证

5、全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍酸性酚的一步法。Trizol试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。TRIzol试剂步骤略图一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果（图2）。另外，分离poly(A)+ RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而

6、，当分析稀有mRNA时，poly(A)+ RNA会增加检测的灵敏度。图2. 总RNA和poly(A)+ RNA在RT-PCR中的比较以5或1g Hela细胞总RNA（分别为泳道1和2）或500ng和50ng Hela细胞poly(A)+ RNA（分别为泳道3和4）。使用oligo(dT)引物和SuperScript逆转录酶合成cDNA。扩增对象为DNA聚合酶mRNA 5端377bp片段和复制酶A mRNA的643bp片段，两者都为中等丰度。将1/10的cDNA合成反应产物使用Taq DNA聚合酶扩增30个循环。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮

7、存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000g离心5分钟。在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA

8、合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解

9、RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。SuperScript逆转录酶，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及ThermoScript逆转录酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA（图3）。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多（图4）。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比，SuperScri

10、p显著提高了长RT-PCR产物的产量（图5）。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42的温度下进行。图3 逆转录酶对cDNA第一链产量的影响在建议的合成条件下，使用oligo(dT)引物和10Ci的-PdCTP。第一链的总产量使用TCA沉淀法计算。全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。图4 逆转录酶对RT-PCR灵敏度的影响图5 逆转录酶对长模板RT-PCR灵敏度的影响以oligo(dT)为引物，使用ThermoScript或AMV，在50下由Hela细胞总RNA合成cDNA。使用Platinum Taq DNA聚合酶和人

11、DNA聚合酶引物进行35个循环。人tuberous scherosis mRNA（5.3kb）和人DNA聚合酶mRNA的全长cDNA的合成由SuperScript和MMLV催化。利用oligo(dT)为引物，由5g Hela细胞总RNA合成cDNA。样品使用RNaseH处理，然后使用ELONGASE? Enzyme Mix将1/10的cDNA合成反应产物扩增35个循环。RNaseH产生的障碍RNaseH对第一链cDNA的影响。RNaseH在cDNA合成期间降解RNA:DNA复合体中的RNA。红色箭头代表潜在的酶切位点。提高逆转录保温温度较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量

12、。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用ThermoScript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增（图6）。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时（见第三章）。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60前在25保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接

13、将RNA/引物混合物从65变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。图6 温度对不同模板的影响使用ThermoScript或AMV，以18S rRNA基因特异性引物，由10ng大豆总RNA在所示温度合成cDNA。将1/10的cDNA反应产物使用高保真Platinum Taq DNA聚合酶进行40个PCR反应循环。表2. 逆转录保温温度 Reverse Transcriptase Incubation TemperatureAMV37C-45CM-

14、MLV37CSuperScriptII RT37C-50CThermoScript RT42C-65CRNA在高于65时开始水解，对于1kb的RNA第一链合成温度可以为70，对于1kb的RNA则需要65。Tth热稳定聚合酶在Mg存在条件下 作为DNA聚合酶，在Mn存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最高65条件下保温。然而，PCR过程中Mn的存在会降低忠实性，这使得Tth聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区

15、分开来。促进逆转录的添加剂包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20的甘油或10的DMSO而不影响SuperScript或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20的甘油而不降低活性。为了在SuperScript逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10的甘油并在45保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4，这不足以抑制PCR。RNaseH处理在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结

16、合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosis（图7）。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了SuperScript或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。图7 RNaseH处理对RT-PCR的影响使用SuperScript（S）、M-MLV（M）或AMV（A），由5g Hela RNA合成人tuberous sclerosismRNA（5.3kb）的全长

17、cDNA，反应产物的一半使用RnasH处理30分钟，使用ELONGASE Enzyme Mix对相当于起始RNA 0.5的经处理及未处理逆转录产物进行35个循环的扩增。小量RNA检测方法的提高当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为250g/ml。在使用SuperScript的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度（图8），而且对于小量

18、RNA，减少SuperScript的量并加入40单位的RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用SuperScript进行逆转录反应时加入BSA或RNase抑制剂。图9 一步法RT-PCR的灵敏度使用SuperScriptOne-Step RT-PCR System从0，0.1，1，10，102，103pg Hela总RNA（分别为泳道1-6）扩增-actin片段。反应在50保温30分钟；942分钟；然后9415秒，5530秒，6890秒进行40个循环；随后在68保温5分钟。反应中包含200 nM正义和反义引物。一步法同两步法RT-PCR的

19、比较两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点（表3）。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增（图9）。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。表3. 一步法和两步法RT-PCR的比较两步法步骤一步法步骤起始第一链cDNA合成使用：起始第一链合成使用Oligo(dT)GSP引物随机六聚体GSP引物优点优点灵活方便引物选择扩增酶同逆转录酶预

20、先混合扩增酶的选择转管步骤少，减少污染可能性困难RT-PCR的优化能力高灵敏度同Platinum酶结合提高特异性适用于大量样品分析同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提高忠实性适用于定量PCR适用于在单个样品中检测几个mRNA关于扩增酶和产物大小应注意：对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶对于小于12kb的产物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity对于大于12kb的产物使用ELONGAE Enzyme Mix对于一步法RT-PCR，如果

21、产物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果产物小于9kb，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。图9 一步法RT-PCR的灵敏度使用SuperScriptOne-Step RT-PCR System从0，0.1，1，10，102，103pg Hela总RNA（分别为泳道1-6）扩增-actin片段。反应在50保温30分钟；942分钟；然后9415秒，5530秒，6890秒进行40个循环；随后在68保温5分钟。反应中包含200 nM正义和反义引物。第三章 增加RT-PCR特异性起始cDNA合成第一链

22、cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20l反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA

23、 3端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20l反应体系使用0.5g oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引

24、物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计（见第五章）。GSP可以同与mRNA3最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20l的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。提高逆转录保温温度为了充分利用GSP特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个GSP退火温度为55，那么如果使用AMV或M-MLV在低严谨性

25、的37进行逆转录，GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而SuperScrip和ThermoScript可以在50或更高进行反应，（表2）这就会消除较低温度时产生的非特异性产物（图10）。为获得最大的特异性，可以将RNA/引物混合物直接从65变性温度转移到逆转录保温温度，并加入预热的2反应混合液（cDNA合成热启动）。这有助于防止低温时分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度转换。图10. 逆转录温度对RT-PCR特异性的影响使用ThermoScript和设计用来同人DNA聚合酶mRNA退火的GSP，由1g Hela RNA合成cDNA。Thermoscript加入到预热

26、的反应混合液中，使用Platinum Taq DNA聚合酶对1/10的cDNA进行35个循环的PCR。减少基因组DNA污染RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了避免产生于基因组DNA的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的DNase对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65保温10分钟以终止DNase消化。EDTA可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解。为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开

27、的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。第四章 RT-PCR应用5 和3 RACERACE（cDNA末端快速扩增，Rapid Ampliphication of cDNA Ends）是一种获得转录本5或3未知序列的方法。不象普通RT-PCR那样使用两个序列特异性的引物，RACE使用一个序列特异性的引物和或者mRNA的poly(A)尾（3 RACE）或者加到cDNA末端的多聚同聚体（5 RACE）（图11）。RA

28、CE已经被用于扩增和克隆稀有mRNA。RACE的产物可以用来克隆，直接测序，制备探针或连接在一起得到全长cDNA。其中一个连接5 和3 RACE产物的方法是使用由5 及3 RACE得到的序列信息设计新的引物，以扩增全长的cDNA。使用RNaseH-的逆转录酶和高保真的热稳定聚合酶可以对较长的序列进行高保真的扩增，从而得到全长cDNA克隆。5 RACE步骤概要 第一链引物，GSP1，同mRNA退火使用SuperScript将mRNA转录成cDNA使用RNase混合物降解RNA使用GlassMAX Spin Cartridge纯化cDNA使用dCTP和TdT对纯化的cDNA加尾使用简并的锚定引物和

29、巢式GSP2 PCR扩增带有dC尾的cDNA使用AUAP，UAP和巢式GSP重新扩增初步PCR产物。图11. 5 RACE步骤概要5 RACE比RT-PCR更具有挑战性，特异性也较低，因为只有一个引物是基因特异性的。5 RACE的产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。结果的质量取决于用来合成第一链和扩增的GSP的特异性、扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA的复杂度和丰度及产物的长度。使用巢式引物扩增（最多可以三轮巢式扩增），并在连续几轮扩增中使用长度选择性的扩增产物作为模板可以增加5 RACE的特异性（见第五章，巢式PCR）。增加逆转录保温温度和PCR退火温度，并降低扩增

30、反应中的镁离子浓度可以促进特异性。5 RACE的灵敏度受所使用的逆转录酶和cDNA 3 末端抑制cDNA加尾（tailing）的二级结构影响。cDNA的不完全合成降低了全长产物的产量，并导致某些模板产生连续条带。因为SuperScript产生更多的全长cDNA，所以可以提高5 末端序列检测的水平，尤其是对于小于1kb的转录本。双链3 末端和发卡结构会通过减少用于加尾的3 羟基而破坏cDNA的加尾。cDNA的起始保温温度在94并随后在冰上冷却有助于破坏二级结构。一些困难模板可能需要加入DMSO辅助加尾（图12）。加尾酶末端脱氧核苷转移酶可以耐受最多20的DMSO。图12. 5RACE在45使用S

31、uperScript从5g Hela总RNA合成cDNA。10l纯化的cDNA在10DMSO中加尾。使用人tuberous scleosis的引物和ELONGASE Enzyme Mix（初步PCR 2.8kb；泳道1）对1l加尾反应产物直接扩增40个循环。在2.8kb条带周边移取10l的凝胶。使用1l限定大小的PCR产物进行巢式PCR（巢式PCR 2.7kb；泳道2）。凝胶使用SYBR Green染色。巢式PCR后如果看不到产物或仅观察到连续条带，可以使用Southern印迹检测产物。这需要了解序列内部信息以制备探针。仅扩增全长cDNA末端的高级RACE方法为了获得全长的cDNA 5及3末端

32、序列，许多研究人员使用称之为cDNA末端快速扩增，或RACE的方法。传统的RACE方法得到的PCR产物含有全长及断裂的cDNA产物。GeneRacerTM试剂盒确保只得到含有全长cDNA末端的完整序列，使您得到更高效的结果并节省时间。GeneRacer的优点确定一个基因的全长序列对于研究异源转录起始和得到用于蛋白表达的开放阅读框至关重要。GeneRacer是一种高级RACE技术，提高了扩增全长cDNA末端序列的效率。使用GeneRacerTM试剂盒，可以得到完整序列 克隆基因片段的全长5和3末端以构建完整的cDNA序列灵敏 得到每个细胞中拷贝数低至30的稀有转录本的全长5和3末端长度 可以由转

33、录本得到长度至少为9kb的cDNA仅通过一轮PCR反应就可以得到这些结果。一般不需进行巢式PCR。全长5末端选择传统的RACE会得到多个PCR结果，因为其所使用的cDNA来源于断裂及全长mRNA。研究人员必须鉴定每一个 PCR 产物以获得带有全长5末端序列的产物。GeneRacer 只针对全长的5加帽mRNA，从而节省了花费在筛选大量PCR产物上的时间。图13 示意GeneRacerTM 的工作原理。RNA样品经CIP和TAP处理，保证GeneRacer 寡聚RNA仅同全长转录本连接。然后使用SuperScript逆转录酶对这些转录本逆转录，得到的cDNA做为PCR的模板。GeneRacer

34、寡聚RNA序列做为GeneRacerTM 5引物结合位点，这样，只有具有全长5末端的cDNA才会被扩增。使用GeneRacer 步骤及高保真度Platinum Taq DNA聚合酶，就可以确保得到最高效的实验结果。图13 GeneRacer步骤图14 稀有转录本和长转录本的扩增结果3.5mg Hela总RNA经GeneRacer步骤处理，利用GeneRacer的Oligo dT引物和SuperScript得到cDNA，然后使用GeneRacerTM 5引物和基因特异性的引物PCR扩增。基因经过30-35个循环的一轮PCR扩增。50ml PCR扩增产物中的15ml在1.2E-Gel 琼脂糖凝胶电

35、泳检测，在紫外光下观察。泳道1: HPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶），1.3kb，30拷贝/细胞泳道2:SMAP（胸腺激素受体共激活蛋白），3.1kb泳道3:Cleavage and polyadenylation specificity factor，4.5kb泳道4:TFRC（转铁蛋白受体），5.0kb泳道5:IGFR（类胰岛素生长因子受体），9kb，5末端GC含量90%敏感性和扩增长度为了说明GeneRacer试剂盒获取全长5末端的能力，我们扩增了带有已知转录起始位点的基因的5末端。使用总RNA，遵循GeneRacer步骤，我们扩增了一个长转录本（9kb）和一个浓度为0.01%，即30拷

36、贝/细胞的稀有mRNA。长度超过GenBank序列除了可以获得已知转录起始位点基因的全长5末端，GeneRacer还可以获得未知转录起始位点基因的5末端。将GeneRacer所得到的序列同GenBank列出的mRNA序列相比较，GenBank的序列一般来源于使用传统方法构建的文库中的cDNA，这导致末端核苷酸的缺失。从表4可以明显看出，使用GeneRacer得到的5cDNA末端要比GenBank中列出的序列长16到116碱基。GeneGenBank Number(mRNA)Size(kb)GeneRacer Sequence Beyond GenBankHeterogeneous nuclea

37、r ribonuclear protein complex K protein(hnRNP K) S746782.3+62Subunit for coatomer complexX704763.1+38Muscle phosphofructokinase(PFKM)M260662.8+16ADP-ribosylation factor 4(ARF4)M36341.11.5+116Isoleucil-tRNA synthetaseU049534.5+49Putative tumor suppressor(LUCA 15)U23946.12.6+81Thyroid hormone receptor

38、 coactivating protein(SMAP)NM_006696.13.1+52Cleavage and polyadenylation specificity factorU37012.14.5+57Human insulin-like growth factor 2 receptorNM0008769.0+44表4说明列出的基因使用GeneRacer步骤扩增。PCR产物使用S.N.A.P.凝胶回收柱回收并克隆至pCR4-TOPO载体（Invitrogen）。对每一个基因都随机挑选了12个克隆并测序。序列同GenBank数据库中的序列相比较，确定5末端超出的序列。使用每个基因所获得的

39、最长序列比较统计超出GenBank序列第一个碱基的超出碱基的数目。获得全长的cDNA序列GeneRacer试剂盒确保您成功获得mRNA转录本的全长5和3序列。每个GeneRacer试剂盒中包含CIP、TAP、RNA连接酶、SuperScript 逆转录酶等酶类及其缓冲液，GeneRacer寡聚RNA，GeneRacer Oligo dT引物，GeneRacer PCR引物及RNase抑制剂。同时试剂盒中还包括S.N.A.P.凝胶纯化柱以纯化PCR产物，还有TOPO Cloning 试剂盒以进行下游测序。使用GeneRacerTM 试剂盒，您可以高效地得到全长的cDNA 5和3末端序列，而不必浪

40、费时间筛选部分缺失或断裂的序列。mRNA表达定量mRNA表达定量是一种挑战性的RT-PCR，但是提供了超越传统RNA分析方法的优点。RT-PCR比Northern印迹或核酸酶保护分析更灵敏，需要的RNA量及序列信息较少。但是RT-PCR涉及两个酶反应，这会导致RT-PCR产物量的波动。RNA转化成cDNA的量会影响产量，但定量PCR的主要困难是PCR的指数增长的特点，样品间很小的差异会被转化成产物产量间很大的差异。两个常用的mRNA丰度定量方法是竞争性定量PCR和实时PCR。在竞争性PCR中，逆转录之前加入一个外源的RNA转录本（内部标准RNA）作为样品间差异的对照。内部标准RNA被逆转录并同

41、目的模板一起扩增，作为cDNA转化和扩增效率差异的对照。通过将特异性的目的序列同已知浓度的内部标准RNA一起扩增进行定量。通过比较由内部标准获得的信号和目的模板所获得的信号可以确定目的模板的丰度。内部标准RNA同目的模板有同样的引物识别位点。有几种现行的方法可以得到内部标准。最简单的方法是使用PCR在非特异性的spacerDNA上建立引物识别位点。产物可以克隆至带有T7或SP6 RNA聚合酶启动子的载体上，或者将RNA启动子序列加到正向引物，从而可以通过PCR构建序列。然后可以通过体外转录得到RNA标准。竞争性定量PCR可以使用GSP在一步法RT-PCR中进行，或使用GSP或oligo(dT)

42、在两步法RT-PCR中进行。可以向反向引物中加入poly(dT)序列得到oligo(dT)序列。竞争性RT-PCR是一种终点分析法，需要目的模板和内部标准的扩增效率相同。需要预先了解起始目的模板的部分信息以建立内部标准的浓度范围。为了精确定量，需要进行内部标准比目的模板多及少的反应。实时RT-PCR是非竞争性的，在产物形成的同时就进行了检测。几种探针可以用于产物量的分析，如荧光标记的5核酸酶探针和Molecular Beacon。第一种方法基于Taq DNA聚合酶的5核酸酶活性，其可以切除延伸过程中在分支点的杂交探针。分析使用两种荧光标记的探针，一种染料作为报告基团，另外一种在探针被切除时淬灭

43、信号。Molecular Beacon包含一个5 flurophore和3 quencher。这些探针设计有一个带有荧光的发卡结构和紧邻的quencher以淬灭荧光。主干结构包括5到7个核苷且富含GC。外层环状结构包含15到30个核苷且同把序列互补。当存在靶序列时，molecular beacon同靶序列结合，发卡结构松散开，从而产生荧光。对于两种探针，使用与光激发检测装置耦联的PCR仪，在PCR的每个循环实时检测荧光。发出的荧光的量同PCR产物的量成正比。当释放的荧光的量超出了一个制定的荧光基线，这个循环称为阈循环或CT。CT同起始目的模板的量成反比。因此，高拷贝数的样品会有一个低的CT值，

44、而低拷贝数对应高CT值（图15）。图15. 眼癌mRNA的实时PCR定量使用Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step System（在60进行cDNA合成）对Hela总RNA的相同两份样品进行PCR。在ABI Prism 7700上使用FAM标记的Molecular Beacon探针（400nM）进行检测。A组. PCR期间两份样品的相对荧光密度。B组. 标准曲线。为了对mRNA进行绝对定量，可以使用体外转录RNA得到标准曲线。通过不同浓度的体外转录RNA可以确定CT值。然后CT值可以同RNA浓度作图得到标准曲线，以定量未知样品的表达

45、水平（图15，B组）。实时RT-PCR提供了超越竞争性RT-PCR的优点。通过对大范围目的模板浓度进行线性剂量响应（图15），荧光监测高度灵敏，高度精确。样品不需要进行扩增后分析，仅需要预先知道很少的目的模板的丰度信息。可以使用两步法RT-PCR对一个RNA样品中的多个mRNA定量，在处理大量样品时，为了方便，可以使用一步法。脱颖而出的定量RT-PCRPlatinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step系统整合了最好的逆转录和PCR技术，提供了全方位的高品质。其产量、特异性和灵敏度都卓尔不群。您会得到mRNA最精确的实时定量。如您所需怎样做才能得

46、到最好的定量RT-PCR（qRT-PCR）结果？把实时定量的逆转录和PCR的领先技术结合在一起就可以了。使用了Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step系统，您就拥有了两种高品质的酶，ThermoScript逆转录酶和Platinum Taq DNA聚合酶，以预先混合的方式，为精确可靠的扩增反应而优化。高效的cDNA合成ThermoScript逆转录酶，一种克隆的鸟类RNase H-逆转录酶，通过基因工程处理，可以在最高65进行高特异性的cDNA合成，其最适温度为50。因为降低了RNase H活性，ThermoScript逆转录酶增加了

47、全长cDNA的产量。因为其较高的热稳定性，可以克服高GC含量和RNA二级结构的障碍，在较高温度下进行高效的cDNA合成（图16）。图16 带有延伸二级结构的富GC RNA的RT-PCR得到高产量使用ThermoScript逆转录酶或AMV逆转录酶，根据生产厂商的建议，由10 ng 总RNA合成cDNA。将反应产物的1/10使用高保真Platinum Taq DNA聚合酶扩增。圈出的带（414bp）表示核糖体大亚基RNA 5端（84 GC）含量的扩增。高产量和特异性在ThermoScript逆转录酶后，您会用到Platinum Taq DNA聚合酶，其在PCR一步中提供了抗体介导的自动热启动功能

48、（图17）。这项技术明显减少了错误配对和非特异性扩增，在高特异性的同时提供了高产量。cDNA合成和扩增的优异结果一起成为成功qRT-PCR的基础。图17 室温条件下DNA聚合酶活性的完全抑制对Taq DNA聚合酶和Platinum Taq DNA聚合酶的活性分析在37进行5个小时。一步得到高灵敏度Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step系统提供的步骤可以高灵敏度地检测起始物质。仅需在反应混合物中加入总RNA或poly(A)，基因特异性逆转录和扩增引物及荧光探针，然后就可以开始实验了。您可以精确定量到最低10个目的RNA分子或从1pg总

49、RNA（图18）。除了高特异性外，一步法步骤减少了反应变量，降低了污染可能性，适合高通量应用。图18 一步法RT-PCR-actin mRNA的定量。使用Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step系统扩增六份不同量的Hela总RNA，然后在ABI PRISM 7700上，使用6-FAM标记的TaqMan探针检测。使用了TAMRA做为报告信号（Rn）均一化的被动参考。超越竞争对手总而言之，领先的逆转录和PCR技术同一步法整合在一起会尽您所需，产量、特异性和灵敏度，得到高水平的qRT-PCR。图19将使用PlatinumQuantitati

50、ve RT-PCR ThermoScript One-Step系统与使用竞争者系统得到的结果做了比较。Platinum系统表现出更低的Ct（阈循环）和更高的产量，使其对于检测低拷贝的mRNA转录本更敏感。图19 使用Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step系统获得高产量 使用Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step系统（蓝点）或竞争对手P的Quantitative One-Step RT-PCR系统（红点），按生产厂商的建议，对145bp的-actin片段进行qRT-PCR分

51、析。起始RNA从5g到50fg按10倍递增变化。使用TAMRA做为被动参考收集均一化的相对荧光（Rn）。图版A：线性量扩增图。图版B：标准曲线图。获得一步法的成功Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step系统提供了实时定量中领先的逆转录和PCR技术。第五章 增加PCR特异性引物设计细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：*典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序

52、列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。*选择GC含量为40到60或GC含量反映模板GC含量的引物。*设计5端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。*避免引物对3末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。*避免3末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。*避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。*避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上

53、并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3端使用简并碱基，因为3端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1M到3M），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对

54、目的模板。引物退火温度引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55到70。退火温度一般设定比引物的Tm低5。设定Tm有几种公式。表5列出确定引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。表5.

55、估算Tm的公式根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5，以2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严

56、谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。递减PCR递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1到2，直到退火温度低于Tm 5。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析。引物浓度引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5M。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数

57、的倒数（nmol/OD），通过Beers法则（公式1）计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式2计算。与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在Gibco/BRL定制引物的质检报告中包含了消光系数（OD/mol）和消光系数的倒数（mol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作为标准，在EB染色的胶上估算引物浓度，因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差异很大。引物纯度和稳定性定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的（表6）。使用Invitrogen Parallel Array Synthesis技术，不必除盐。

58、同其他方法相比，在Parallel Array Synthesis技术中，通过脱盐而除去的苯甲酰基和异丁酰基很少，因此不会干扰PCR。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3到5合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。表6. 用于PCR应用的引物最低建议纯度ApplicationMinimum Suggested PurityPCRStandardFirst-strand cDNA synthesis f

59、or RT-PCRStandardAFLP technologyStandardPCR using primers with 5 sequences(restriction endonuclease sites,RNA polymerase promoter sites,etc)CartridgePCR primers 50basesPAGECycle sequencingStandardIsothermal sequencingDesaltedSite-directed mutagenesisCartridgeCFLP techmologyDesalted引物产量受合成化学的效率及纯化方法的

60、影响。Invitrogen?以一个最小OD单位确保总寡核苷的产量（表7）。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100M。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。表7. 各种纯化方法的最低寡核苷酸产量 Minimum Yield(OD) for Different Primer Purities*Number of BasesSynthesis ScaleStandard/DesaltedCartridgeHPLCPAGE大于2050nmole22NANA200nmole88311mol202010310mol200NA10030大于等于2050nmol