微生物实验室规范

1、1117微生物实验室规范引言微生物实验室规范包括以下方面：无菌保障技术，培养基质控，实验用菌株质控，仪器设备质控，严格的记录程序，实验室数拟评估体系以及实验室人员培训制度。由于微生物测定数据的不可重复性和变异性是客观存在的，所以客观公正的方法和严格执行GLP规范是保证微生物实验数据时可信和重现的重要前提。培养基的配制和质量控制培养基配制绝人多数的微生物实验需要用到培养基。供微生物实验室用的培养基的质量控制是微生物实验室正常运转的保障。通过控制培养基配制、贮藏条件和质量测试环节，实现对“微生物实验室专用培养基”质量控制。选择正确的成品培养基，或基于文献或使用公认的配方，正确选择培养基组分对于微生

2、物实验是至关重要的。培养基生产商提供的培养基产品都应具有培养基配方和使用说明，且这些信息仅是针对脱水培养基或预制培养基产品制定。通常，不同种类的培养培养基可能会有不同制剂方法，例如加热、使用添加组分、调节pH等。所以为了保证培养基质量，必须按照产品说明书要求配制培养。预制培养基必须明确标识其失效期和保存条件，同时也得满足该培养基“促生长实验”和“选择性实验”中涉及的质控菌株的生长要求。水是微生物用培养基配制中最常用的配制溶剂。通常用纯化水，在某些特殊情况下也使用去离子水和蒸馏水配制培养基。严格记录配制各种培养基所用水的体积。准确称量脱水成品培养基成培养基的各组分，是培养基配制重新性的保证。称量

3、培养基的天平需经过严格的校准，并且满足称量量程的要求（参见分析天平称量要求1251）。必须保证称量容器和工具（如称样勺）的洁净程度，以避免外源物进入从而造成培养基组成的改变。严格记录称样重量。脱水培养基在灭菌和分装之前，需保证培养基组分在水中充分分散均匀。由于培养基有一定的热敏感性，因此对于必须加热溶解的培养基，要特别注意不宜过度加热。培养基配制过程中使用到的仪器，必须具备温度可控、恒压和可充分混匀的特点。培养基颜色变深（多为梅拉德反应或非酶褐变反应）通常是加热过度的指征。当培养基需要添加某组分时，应保证加入的组分在培养基中充分分散均匀。如果配制培养基的玻璃容器洁净程度不够.就可能向培养基中引

4、入抑菌物质。由玻璃容器不洁净引入的抑菌物质，主要是玻璃器皿清洗后残留的去垢剂，或是前一次使用后残留的有抑菌性的样品。所以，必须严格设定清洗程序以去除残留的污染物和外源性成分，确保使用纯化水彻底清除残留的去垢剂。具体参见“玻璃器皿清洗法1051”中的相关指导原则。培养基的灭菌程序，应该严格按照生产商提供的灭菌条件和参数进行，使用者也可以采自行验证过的来菌程序灭菌。商品化的预制培养基必须提供该培养基采用的灭菌参数文件。如果企业能够提供某公认的生物指示剂条件下，该培养基的无菌保障水平（SAL）,那其灭菌参数就更有实际意义。高压蒸汽灭菌是常用的灭菌技术，但是当培养基中有热不稳定的组分时，则应采用煮沸的

5、方式灭菌。当然，对于某些特殊的培养基，薄膜过滤除菌是更为有效的灭菌方式。具体培养基灭菌方法和参数的有效性，需要通过“培养基无菌性”和“培养基的促生长实验”来证明。此外，在选定载荷量和载样体积条件进行湿热灭菌时，高压灭菌程序应通过验证保证合理的热分布，以达到灭菌的目的。通常，生产商邰推荐T21C,15分钟”的灭菌条件，前提是高压灭菌锅已经通过验证程序的检查，所谓参数，也就是某培养基的灭菌时间和温度。由于灭菌锅的装载量与方式影响加热速率，当载样量大时通常需要延长灭菌时间，灭菌时间应根据培养基的体积和和高压灭菌锅的装载情况而变化。升/降温速率太慢的灭菌锅可能会导致培养基过度加热。因此，只能通过灭菌程

6、序验证过程，才能实现对上述环节的合理控制，制定出符合要求的最低无菌保障水平（SAL）,既能满足培养法的灭菌要求，又可避免由于加热过度导致的培养基降解变化。湿热灭菌结束，待高压锅冷却后应立即取出培养基，不宜在高压灭菌锅中存放培养基。无论对于商品化培养基还是实验室自制培养基，不适宜的加热、灭菌参数都可能导致培养基颜色变化、澄明度下降、凝胶强度改变或是pH值偏离厂商提供的酸度范围。每批培养基的酸度都应在灭菌后，冷却至室温（25C）无菌条件下取样，测定。通常，平面pH电极用于对固体培养基表面pH值的测定，插入式pH电极则多用于液体培养基酸度的测定。pH计的校准和使用参见pH值测定法791中的指导原则。

7、通常，商品培养基灭菌后pH值应该在生产商提供的酸度值0.2的范围内；特殊情况下，如验证实验证明某培养基的酸度值范围可以较宽，那么就可以接受更大范围的酸度偏离。使用预制培养基时，应在其包装试管或平皿）标识处注意以下几点：盛放培养基的容器或盖子是否裂缝；平皿内培养基共表面是否平整；固体培养基是否因为脱水而导致开裂或表面塌陷；血琼脂平板是否有溶血现象；颜色基否过深，颜色是否与以往不同；是否有出于冰冻可能造成的结晶析出；是否有过多的气泡：是否长菌；氧化还原试剂的状态（仅针对对某些特殊培养基）记录并检查培养基批号及效期；培养基的无菌性；平皿的洁净程度（盖子不应该接触到平皿内部）。培养基的贮藏了解培养基在

8、使用之前（生产商、销售商）对其运输和保存的条件，对于使用者十分重要。对于预制培养基，培养基生产商应确保环境条件（如温度控制、物理保护）避免其水分的挥发。培养基商品应该淸楚标识出该产品的名称、生产批号、制备日期、效期等信息。实验室成按照制造商产品说明书的要求贮藏培养基。自制培养基应置于验证过的保存条件下保存。由于低温冷冻会破坏琼脂的结构，困此含琼脂的培养基保存温度不得低于0C,且通常作避光和低温环境中保存。若要长期保存，应置于无菌密闭的容器或袋子中，以减缓水分挥发、防止水分流失。已灭菌但未使用完的固体培养基凝固后，只能再融化一次使用。因为，再次加热和潜在的污染已经使得培养搞的效力降低。微波炉和电

9、加热板是最常用的两种培养基融化方式。但使用时，要特别留意避免过度加热对培养基造成的破坏，也要注意加热后玻璃器皿和其中培养基可能对实验室人员造成的划伤、烫伤等。通常推荐采用水浴和常压蒸汽法再融化培养基。融化好的琼脂培养基在4550C的水浴环境是保温不得超过8小时；在倾注培养基时应特別注意避免将器皿外表面的水带入无菌培养基。操作时应先擦干培养基容器的外表面，再进行倾注。对用毕培养基（包含超过效期）的处置应按照国家污染废物处理相关规定进行。质控实验微生物生长用培养基由各种不同的组分组成，为了便于使用，各实验室可以购买干粉培养基自行配制或者直接购买商品化的预制培养基（常用平板或玻璃容器保存）。培养基制

10、造商应努力从培养基生物原材料的来源方面实现标准化，但各种来源于自然界的原材料的差异是不可避免。因此，培养基批次间的差异性是客观存在，且不能忽视的。无论是实验室的自制基养基还足商品化的预制培养基，其配制过程都是影响培养基质量的决走因素。不正确的培养基配制过程可能会造成微生物生长条件不适合，或是回收中，结果异常，导致不可信的实验结果。所有已制备好且可直接使用的培养基必须进行质控实验。实验室自配培养基的常规监测项目有pH、促生长实验，通过定期的稳定性检査以确定有效期。如果没有其他的相关指导文件，实验室已经按照标准操作保证培养基配制的合理性，并且经过已验证的灭菌程序灭菌，此时，采用同批干粉培养基配制的

11、培养基仅需要进行一次促生氏能力检査即可。如果培养基的配制过程没有得到验证，那么同批配制的培养基都应该进行促生氏能力测试。促生长能力测试用的试验菌株，可以使用药典在培养基促生长能力测试相关章节中规定的菌株，也可以使用从生产环境及产品中分离的常见的污染菌株。培养基在有效期内应符合培养基促生长能力测试的要求。但是，培养基的效期仅取决于其在一定存放条件下（如包装种类、密封方式等）培养基组分和配方总体的稳定性。当培养基促生长能力测试不符合规定时，应寻找不合格的原因以防止问题重复出现。任何不符合促生长实验要求的培养基均不能使用。些诊断试剂可协助鉴别微生物，例如革兰染色剂以及氧化酶试剂。和培养基质控过程一样

12、，对这些常用试剂也要建立相应的质控指标。在使用上述试剂对未知样本进行测试之前，应按照制造商的建议选择正确的微生物完成试剂的质控程序。用于无菌检查的培养基，应对其灭菌条件和贮存环境严格监控（参见无菌检查法中的要求）。用于环境监控的培奍基必须特別防护，最好采用经过终端灭菌并且具备双层包装；如不能采用终端灭菌，使用前应进行预培养，并在受控的洁净环境下检查，以防止将外来的污染物带入受控环境，从而防止假阳性结果。使用触皿监测环境时，应适当提高培养基中琼脂的含量。菌种保存生物样本是最复杂的样本之一。由于微生物具有可变异性，并且其特性依赖于适宜的实验操作和贮藏条件，因此通过对实验室菌种处理和保藏程序的标准化

13、，可以最大限度降低菌种被污染的概率，并使其生长特性改变最小化。按统一的操作程序制备菌株是保证微生物实验结果一致性的重要环节。常规实验用到的菌种通常来源于国家菌种保藏中心，菌种可能处于冷冻、冷冻干燥、斜面或可直接使用等各种形式。对菌株进行质控实验之前，应明确测试菌株的纯度和种属，对实验室常用菌种的鉴定，更应如此。对实验中常用菌种的鉴定，最好采用适宜的技术将目标菌株鉴定至种或基因水平。菌株的复苏和制备应参照供应商提供的或已经过确证的方法。通常采用“种子批”技术对菌种进行传代。国家菌种保藏机构获得的标准菌株应在适宜的培养基上进行复苏和生长。标准菌株保存时，可将培养物分散在抗冷冻的培养基中，并分装于小

14、瓶；使用之前将其贮藏于-30C以下。采用低于-70C或者低温冷冻干燥法保存菌株，可以大大延长菌种的保存时间。标准储备菌株用于制备需每月或每周一次转种的工作菌株。冷冻菌株一旦解冻用的种制备工作菌株后，不得重新冷冻和再次使用。未使用部分应丢弃，以避免活力丧失或贮藏中可能被污染。工作菌株的传代次数应严格控制以防止过度传代增加菌种变异的风险。工作菌株的1代是指将有活力可继续生长的菌种接种到可供微生物生长的新鲜培养基的过程。任何形式的接种过程均被认为是转种或传代一次。实验室设备实验室设备（培养箱、水浴锅以及高压灭菌设备等）都应具备标准的认证程序，包括对来源资质的审查、标准操作程序的确认以及性能测试。每年

15、一次的期间是必需的。对于新购置的仪器，需要经质量监管部门的（QAU）核查后才能在实验室使用。此外，应建立培养箱、冰箱以及水浴锅的定期清洁和消毒机制，将实验室存在的潜在微生物污染最小化。定期检查冰箱和培养箱的密封封条，确保其洁净度和密封性能，如有问题及时维修。微生物实验室所使用的仪器（pH计或分光光度计等）应按照日常使用的情况进行定期校准并记录。校准的周期和校验的内容应根椐仪器的类型和其在实验中产生的数椐的重要程度分别进行控制。试验设备（如冰箱和培养箱）可用于无菌检测用培养基以及无菌检测样品的培养和存放.也可用于活体微生物的培养存放。因此，尽管保持其清洁的程序较为繁琐，但也应保证这些设备的洁净，

16、以最大限度地降低其在使用过程中可能导致的污染。高压灭菌设格通常是微生物实验室工作的核心，因此对此类设备应具备合理的验证程序文件保证各种实验活动中灭菌过程的有效性。应分別在不同的灭菌设故设备中完成工作用的洁净培养基的灭菌程序和废弃培养基的灭菌程序。要求采用不同的灭菌设备并非出版对无菌产品和微生物活体应分別来菌的要求，而是出于对实验室溯源的考虑（参考下文）。实验室布局及运行实验室布局和运行应充分兼顾满足微物GLP实验室的实验操作以及实验室安全的要求。实验室的布局设计应最大限度防止可能的微生物交叉污染并防止检验过程可能对环境和人员所造成的危害。通常，实验室成划分成相应的洁净区域和活菌操作区域。无菌产

17、品保存及培养的区域应尽可能满足无菌要求。若洁净区域与活菌操作区域不能完全分离，也应采取其他的保障手段或灭菌手段降低发生意外污染的可能。这些防护手段包括防护服、清洁与灭菌程序以及无菌操作专用的生物安全柜。此外，还应配备防止活菌意外泄漏的设施，并且应对相关操作人员进行培训。实验部分样品会检出有微生物生长，此时应进一步对其鉴别，以得到更详尽的实验室数据。一旦发现有微生物生长，样品成立即从洁净区域转移到实验室的活菌操作区域进行转种、染色、鉴別及其他确定实验。任何出现微生物生长的样品不得在实验室洁净区域打开。对染菌的样品以及其他实验材料应进行有效地隔离以减少假阳性结果的出现。实验人员需采取特殊的防护措施

18、，穿戴防护手套才能进入活菌操作区工作，工作完成后应仔细消毒双手后再退出。理论上，处于无菌操作工作状态的实验人员不应再进入实验室活菌操作间工作。如果未采用无菌保障预预防措施（无菌操作），由于保障环节的不够可能造成样品被微生物污染，导致假阳性结果。实验室设计时应注意所有的物品均应处于受控条件下操作，例如适宜的更衣系统和无菌取样装置。尽管对实验室洁净环境下的功能系统进行无菌采样监测（例如水循环体系）的可行性不大，但若不在无菌操作条件下完成取样，结果的可靠性就会很大程度的降低。环境采样时，取样过程中应尽可能的使用消毒灭菌技术处理取样设备。如果可能的话，最好在取样杯境中安装环境采样仪器和采样用的微生物培

19、养基。实验室工作的所有关键实验过程都应在可控条件下进行，例如对于终产品制剂、散状产品的无菌检查，微生物产品或传代细胞培养产品。也可以在隔离器中进行微生物学检查。与有人为因素参与的无菌间相比，实隔离器中出现被环境微生物污染的概率大大降低，出现假阳性结果的机会也更小。隔离器应使用化学消毒剂进行消毒灭菌，为保证环境的完整性并且防止假阳性结果，消毒后的隔离器应经过验证再使用。（参见“无菌检查隔离器系统的验证”中的相关指导原则。）样品处理从水、环境监控和样品中分离出的活体微生物样本对处理方法和保存条件都比较敏感。在上述情况下，样品组分、容器成分、保存时间和保存温度等条件对分离到的微生物样本而言都是较为严

20、苛刻的临界条件，所以，应当尽量缩短从供试品制备到样品测试的时间间隔，并控制环境条件，保证其尽时能的适立微生物生长，如果供试样品需要经过转移后再进行测试，转移的条件（如时间、温度）都应该经过严格的验证，以保证转移条件适用于样品和实验。关于水测试的指导原则，参见制药用水相关内容。测试取样前对样品的混匀过程，应确保对供试样品液体中微生物的分散和复苏。对于需要进行微生物检查的样品，无论是进行无菌实验或是限度检查，都应该经过表面消毒处理。如果条件允许，对供试样品的处理应该在洁净环境下的特定区域完成，并且该区域应该尽可能地接近检测区域，尽可能减少传递过程中可能引入的污染。进入微生物实验室的样品应具备相关的

21、文件资料，包括样品的详细来源、收检日期、报告提交日期、经手人、样品提交部门以及样品中是否存在危险因素等信息。收检部门应确认样品资料，并且核对样品名称、编号等相关信息。微生物检查用培养基培养时间微生物实验的培养时间少于3天，用小时表示，如“在3035C培养1872小时”当测试时间大于72小时，用天表示，如“在3035C培养35天”使用小时表示培养时间时,培养时间不得少于最少培养时间；当满足培养时间的最大值时，通常可以得到较好的实验结果。当以天为单位表示培养时间时，培养若始于某天上午或下午，那么结束时也应该满足培养天数后那一日的相同时间。人员培训每个参与药品生产的人员均应具有一定的培训教育背景，使

22、其拥有一定的工作经验。从事微生物实验的实验人员以及其监管者也应具有一定的微生物或相关的生命科学背景，应按照他们的技能水平与经验赋予其各自的职权。微生物实验天之骄子在运行中必须具备完整的标准操作（SOP）系统。在培训中必须明确该系统具有两个目的。首先，SOP是必须遵循的操作规程，微生物实验人员通过对其学习才能确保实验结果的准确和重现。其次，实现对特定的微生物实验人员所进行过的SOP培训进行追踪，通过SOP编号或者名称可知晓该人民是否接受了符合其工作职能的培训。应针对每个不问岗位的实验人员制定不同的培训计划。在其有资质进行实验之前，实验人员不能独立完成实验。培训记录应时时更新，并针对特定微生物实验

23、的SOP进行适当修改后，再记录实验人员的培训情况。定期绩效评估是数据质控的明智选择。它应包括实验室核心实验人员的技能，例如无菌技术，文件管理以及其他微生物实验人员的实验技能。微生物实验管理人员也应进行内部培训，例如：管理技能，实验室安全，实验安排，预算，实验研究，实验结果的评估和数椐偏差的调查，技术报告的书写以及其他实验室运行所必需的培训。能力是需要通过专业学习，工作经验和定期的培训累计形成的。获得专业授权机构的资质认证是能力素质的一种体现。此外，实验室的主管和管理人员也应具备认证机构的资格认证证书，表明其可以胜任该实验室的管理工作。除科研工作和委托检验外，微生物实验室的技术可以通过很多途径获

24、得。每个单位都应该建立对微生物实验人员资质的考核程序，包括对其设计、执行实验和微生物操作技能的评价。通过这些程序，才能保证技术操作人员能领会微生物学科的基本原理，确保技术人员对科学的符合方针和管理规范的理解。这些考核程序也应有利用发挥有丰富理论基础和实际操作经验的人员的技能，且在相关专业领域帮助那些专业知识储备水平不高的工作人员。微生物学与分析化学和工程学的理论基础完全不同，是基于生物学原理违立的一门科学性较强的专业学科。正是由于该学科的特殊性，所以对于没有经过系统微生物学培训的人员，通常不能较好地胜任这项工作。实验室资源在实验室管理方面，实验室需要保证有足够的资源满足实验的需要。这就要求实验

25、室应具备较强的实验保障、预算管理和实验室业务决策等方而的能力。对实验室检测活动频次的统计是一种有效的管理方式，当然仅靠这一点是不足以说明任何问题的。除了上述的跟踪调查外，还可以追溯样品收检到检验活动开始之间的时间及实验结束节提交报告的时间，如果在这些过程中存在略微延误现象，则提示实验室工作人员末按照规矩执行登记管理。实验室的管理也需要有足够的物资保障，以保证检验工作的需要。详细的预算要求只能针对某一特定的实验室进行制定，但由于预算计划与与实验室的物资储备直接相关，因此必须满足实验室的各种物资保障，这样才能确保测试结果的可信度。文件文件应当充分表明检验任务是在实验室按可控的检查方法进行的。一般包

26、括以下方面：人员培训与资格确认；设备验证，校准和维修；设备使用中的运行状态（24小时运转记录，或7天运转记录）；培养基配制、无菌性检查、促生长能力检查以及选择性评价；培养基的库存记录及质控测试记录；检验规程中关键步骤的说明；数据记录与结果计算的确认；QAU或质虽责任人对实验报告的评估；数据偏离的调查（如需要）实验记录实验结果的可靠性依赖于实验中严格按照标准操作规程进行。标准操作规程应详细说明如何进行正确的实验操作。实验记录应包含所有关键的实验细行，以便确认数据的完整性。实验室原始记录至少应包括以下内容：实验目期；检品名称；实验人员姓名；标准操作规程编号；实验结果；偏差（存在时）；实验参数（所使用的设备，菌株，培养基批号）；主管/复核人签名。实验中所使用的每一个关键的实验设备均应记录在案，备有校正的SOP以及维修记录，并且应该有近期的相关记录。设计合理的设备日志或表格，以满足实验记录的追踪性。设备（水浴、培养箱、灭菌锅）温度必须定期登记，具布可追溯性。管理的SOP中应该明确记录的修改原则，实验记录写错时，用单线划掉并签字。原来的数据不能抹去或被扭曲。实验结果应包括原始菌数，以便复验者对实验结采进行重新计算。标准操作规程（SOP）中应详细记载数椐分析方法。如果记录本中需要使用图表进行表述，那么这些图表应该被保护，不得在图表页中随意添