蓝白斑筛选的原理及方法

1、创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日蓝白斑筛选的原理及方法之巴公共开创作创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日载体pGEM左B-半乳糖甘酶（lacZ）的 “肽编码区内具有多克 隆区域。在重组质粒中拔出片段使-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。不带有拔出片段的载体，表达有功能的（3-半乳糖甘酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源 -肽失活。载体pGEM或其它含lacZ基因的 %-肽互补细菌，具有（3-半乳糖甘酶的 片段，所得功能B-半 乳糖甘酶（口 -肽加片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产 品，得到蓝色菌落。在载体pGEMZ勺多克隆区域，克隆上拔出片段导致-肽编码区

2、的破坏，使（3-半乳糖甘酶失活，得到白色菌 落。0c -肽编码区读码框内小的拔出片段发生浅兰色菌落，因 （3- 半乳糖甘酶只是部分失活。重组质粒转化到合适的菌株中（JM109, DH5%）,然后涂布到含 0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal 指示平板上。可将 50ul 的 X-Gal 和 100 ullPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在 37oC 保温30分钟使液体扩散。IPTG溶于水中，贮液浓度为 100mM X- Gal溶于DMF贮液浓度为50mg/ml。IPTG和X- Gal需分装后保 管在-20 oC ,可保管2-4个月。 IPTG 即 Isopropyl 3

3、-D-1-thiogalactopyranoside ,也称 Isopropyl B -D-thiogalactoside ,中文名为异丙基-B -D-硫代 半乳糖甘。分子式为 C9H18O5S,分子量为238.30, CAS Number 367-93-1 , Ultra Pure , dioxane free ,纯度 99.6%。我公司提 供Merck公司该产品。本产品为接近白色的粉末经常使用分子生物学试剂，经 常使用于蓝白斑筛选及IPTG诱导的细菌内的蛋白表达等。IPTG 是B -半乳糖甘酶的活性诱导物质。基于这个特性，当pUC系列的载体DNA（或其他带有lacZ基因载体DNA以lacZ

4、缺失细胞创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA8行转染时，如果在平板培养基中加入 X- Gal和IPTG,由于（3 -半乳糖甘酶的 0c -互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。止匕外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用.使用方法：首先把IPTG配制成24 mg/ml （100 mMD的水溶液，并进 行过滤除菌后保管。然后在100 ml的琼脂培养基中，加入 100口 的上述溶液、200 口 的X-Gal （20 mg/ml的二甲基甲酰胺 （DMF 溶液）和 100 口 的 Amp （100 mg/ml）,制作成 IPTG、X-Gal、AmpF板培养基。当DNA片段拔出至pUC系列载体（或其 他带有lacZ、Amp因载体），然后转化至lacZ缺失细胞中后， 涂布上述的IPTG、X-gal、Am汗板培养基，可根据长出菌体的蓝 白色，而方便地挑选出基因重组体（白色为具有DN破出片段的基因重组体）。保管条件：粉末在-20 c稳定保管至少三年，具体请参考各个厂 家提供的保管条件 注意事项 ：培养噬菌体时，T