SNT1247.1-2003猪繁殖和呼吸综合征间接免疫荧光试验

1、SNT1247.1-2003猪繁殖和呼吸综合征间接免疫荧光试验1范围本标准规定了猪繁殖和呼吸综合征的间 接免疫荧光试验诊断方法。本标准适用于猪繁殖和呼吸综合征的诊断、 流行病学调查、 检疫和疫情监测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准. 然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。3.1缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1 IFA间接免疫荧光试验。3.2 FITC异硫袱酸荧光黄。3.3 PRRS猪繁殖

2、和呼吸综合征。4 检验检疫4.1 原理接免疫荧光试验是将抗原吸附于固相载体上，抗原与抗体反应后，再用荧光素标记的抗抗体与其反应形成抗原-抗体-抗抗体复合物，在荧光显微镜下可见荧光。本标准是以9 6 孔板为载体，将接种猪繁殖和呼吸综合征病毒的细胞固定于9 6 孔板上，依次加入被检血清和用FITC 标记的兔抗猪抗体，反应结束后，置荧光显微镜下观察结果。4.2 采样采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜透明不溶血无污染，密装于灭菌小瓶内，4 或-2 0 -3 0 冰箱保存或冷藏条件下立即送检。试验前将被检血清 统-编号。4.3 设备和材料4.3.1 仪器设备 微量移液器； 保湿盒； 普通恒温箱及二氧

3、化碳恒温箱； 普通冰箱和低温冰箱； 倒置显微镜； 荧光显微镜； 量筒、 烧杯等。4.3.2 材料和试剂-MARC-145或HS2H细胞由国家质检总局认可的单位提供；- PRRS 美洲标准株A T C C V R - 2 3 3 2 或欧洲标准株 L V标准毒由国家质检总局认可的单位提供 ；-PBRS病毒标准阳性血清和标准阴性血清由国 家质检总局认可的单位提供；- FITC标记的兔抗猪抗体由国家质检总局认可的单位提供，-MEM营 养液(含1000犊牛血清) ；- PBS液(见附录A) ；- EDTA- 胰蛋白酶消化液(见附录A) ； 青霉素和链霉素； 犊牛血清；- 96孔、48孔细胞培养板和细胞

4、培养瓶。4.4 IFA诊断板的制备用EDTA - 胰蛋白酶消化液消化MARC-145H 或HS2H细胞，用MEM营养液稀释成105细胞/ml ，加入PRRS标准毒(美洲标准株ATCC V R - 2332或欧洲标准株L V)，使其最终浓度为100TCID50/25l (TCID50测定见附录B )，加到96孔细胞培养板的1，3，5，7，9 ，11列各孔内，每孔100l。在2，4 ；6，8，10，12 列各孔内加入未感染病毒细胞悬液 10 0l。将该细胞培养板置37，5%二氧化碳培养箱中培养48h -72h，当细胞出现20写CPE时，弃去培养液，每孔加入-20的无水乙醇100l (或80的丙酮溶

5、液100l， 4 固定3 0min，弃掉丙酮溶液，置室温下风干)，置于-20或-70冰箱中备用。4. 5 IFA试验4.5.1 取 IFA诊断板并编号，( 如果用无水乙醉固定，弃去板中的无水乙醇，置超净工作台中风干) 每孔加100lPBS液洗-次，弃去PBS液并倒置在吸水纸上轻轻拍干。4.5.2 在编号对应的孔内加入20倍稀释的被检血清： 同-排相邻的感染细胞孔-个及其后无感染细胞孔-个，每孔100l，同时做标准阴、阳性血清及空白对照，空白对照是用PBS 液代替血清，将反应板置保湿盒中，3 7 恒温箱中感作4 5min。4.5.3 弃去板中液体，用PBS液洗板四次，每孔100l，每次3min，

6、最后倒置在吸水纸上轻轻拍干。4.5.4 每孔加入工作 浓度FITC 标记的兔抗猪抗体5 0l，将反应板置保湿盒中，在37 恒温箱中感作45min。4.5.5 弃去板中液体，同4.5.3 方法洗涤。4.6 结果判定4.6.1 判定方法荧光显微镜采用蓝紫光( 滤板通常用BG12，吸收滤板用OG1或GG9)， 5 倍-10倍目镜。4.6.2 判定标准在所设对照都成立的情况下，即标准阳性血清对照中感染细胞孔应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞孔不应出现特异性荧光； 标准阴性血清对照、 空白对照中感染细胞孔和未感染细胞孔均不应出现特异性荧光； 被检血清对照中未感染细胞孔不应出现特异性荧光。被检血清样品感

7、染细胞孔出现特异性胞浆亮绿荧光的判为阳性； 被检血清样品感染细胞孔未出现特异性胞浆亮绿荧光的判为阴性。附 录 A( 规范性附录)IFA试验中试剂的配制本附录中 试验用水须符 合GB6682 -1992的要求。A.1 PBS液( 0.01mol/LPBS，PH7.2)氯化钠(NACl) 8g氯化钾(KCl) 0.2g磷酸氢二钠( NA2HPO4) 1.15g磷酸二氢钾( KH2PO4) 0.2g二级水加至 1000ML分装后保存于4 备用。保存期3 0 天。A.2 EDTA-胰蛋白酶消化液胰蛋白酶( 1：2 5 0 ) 0.5g乙二胺四乙酸二钠( EDTA ) 0.2g氛化钠( NACl) 8g

8、氯化钾( KC1 ) 0.4g葡萄糖 1.0 g碳酸氢钠( NAHCO3) 0.58g青霉素 2X105 IU链霉素 100mg- 酚 红 0.02g二级水加至 1OOOml0.22m滤膜过滤除菌后分装，保存于-20备用。保存期-年。附录B( 规范性附录)猪繁殖和呼吸综合征病毒TCID 50 测定B.1 稀释病毒取洁净无菌的48孔细胞培养板，于第-孔加MEM营养液200l，其余各孔加225l；换吸头，再于排头第-孔添加病毒液5 0l，将混合液充分混匀。换吸头，吸取2 5 u L 移于第二孔，混合。更换吸头，再吸取25l加入第三孔。连续如此操作至第10 列，作成10个连续10 倍的稀释液，使病毒

9、稀释度依次为5X10 0，5X101，5X102，5X103 ，5 X104，5X105，5XlO6，5XIO7，5X108，5X109。用微量移液器吸取每-稀释度的病毒液50l移入另-块96孔细胞培养板，每个稀释度的病毒液平行接种四孔。剩下的各孔加50lMEM营养液，留作细胞对照。B.2 添加细胞MARC-145或HS2H细胞经细胞分散液分散消化后计数，用MEM营养液稀释至2 X10 5 细胞/ML的细胞悬液，于细胞培养板各孔内添加50l。 此时，病毒稀释度依次变为101、 102、 103、104、105、106、107、108、109、1010。B.3 培养封板后，放375%二氧化碳保湿恒温箱内培养。B.4 观察与TCID 50计算在倒