分子诊断的临床应用现状和展望

1、分子诊断的临床应用现状和展望分子诊断技术及临床应用3Bridging a Historical Divide蛋白RNADNA蛋白RNADNA细胞生物学分子生物学 药物 组织 / 器官 生理-病理学临 床 诊 断 分 子 诊 断转归 预后 精准治疗对分子诊断整体需求正常对照隐匿病例基因型、表型传统的流行病学调查肿瘤风险预测模型的建立确诊病例基因型、表型临床病理因素治疗疗效数据预后随访信息预后预测药物疗效预测药效学评估肿瘤早期干预治疗方案选择药物选择治疗剂量调整分子诊断与个体化治疗癌症分子诊断和分型。随着人类基因组计划完成、HapMap计划和蛋白组计划的进行而产生了新的学科和临床诊疗手段，利用基因

2、结构和表达变化，在分子水平上对癌症进行诊断和分类；癌症的个体化治疗。个体化治疗是“分子医学”时代的特点。某种药物只对有着特定基因变异的特定患者群有疗效。确定不同癌症患者的分子改变，在选择治疗方案时真正做到“对症（分子）下药”；癌症个体化治疗（靶向治疗）的前提就是明确肿瘤的特异靶基因变异类存在与否和变异类型。临床常用分子诊断技术免疫组织化学（IHC）技术检测蛋白分子原位杂交DNA，RNA荧光原位杂交（FISH）技术DNA，RNA荧光定量PCRDNA，RNADNA测序技术DNA突变生物芯片技术DNA，RNA，蛋白质等1. 基于荧光定量PCR技术的检测项目名称检测意义EGFR基因突变EGFR-TKI

3、靶向筛选KRAS基因突变EGFR-TKI靶向筛选BRAF基因突变恶黑、甲状腺癌靶向筛选、肠癌预后预测PIK3CA基因突变肠癌、乳腺癌预后预测病原体核酸定量EBV、HBV拷贝数诊断、复发监测ERCC1 RRM1表达量分析铂类、紫杉醇疗效预测2. 基于FISH技术的检测检测项目检测意义HER2扩增herceptin靶向筛选EGFR拷贝数EGFR-TKI靶向筛选ALK断裂Crizitinib靶向筛选N-myc扩增NB预后1p、19q缺失胶质瘤辅助诊断、用药指导尿路上皮脱落细胞染色体异常血尿筛查BCR-Abl融合慢粒辅助诊断、Imatinib靶向筛选hTERC扩增CIN转归SS18断裂滑膜肉瘤辅助诊断

4、IGH/BCL2染色体易位淋巴瘤辅助诊断EWS断裂PNET辅助诊断PAX3-FKHR易位腺泡状横纹肌肉瘤辅助诊断3. 基于测序技术的检测技术名称检测项目检测意义测序EGFREGFR-TKI靶向筛选CKIT、PDGFRAImatinib靶向筛选UGT1A1等SNPCPT-11等化疗毒性预测NORCH1、FWT7突变儿童T细胞淋巴瘤预后预测IDH1突变间变胶质母细胞瘤预后预测片段分析技术微卫星不稳定性检测2期肠癌5FU化疗预测Lynch综合征筛查毛细管电泳技术淋巴瘤Ig、TCR基因重排淋巴瘤辅助诊断4. 基于高通量技术的检测技术名称检测项目检测意义基于基因芯片技术的肿瘤多基因突变分型检测19个基因

5、靶向筛选二代测序BRCA1/2、APC突变基因组测序基因突变套餐式检测风险预测乳腺癌分子诊断与个体化治疗Her-2基因扩增；Top-2A基因缺失和扩增；ER, PR表达与内分泌治疗；BRCA1、BRCA2基因突变检测；ERCC1等基因表达定量分析；实现筛查、治疗、预后评估综合防治目标靶向筛选HER2化疗预测TOP2A易感筛查BRCA1/221基因表达谱乳腺癌-关爱她人1.000.750.500.25 0累计生存率0 24 48 72 96 120 144无扩增扩增基因扩增: 10 拷贝数无基因扩增: 3拷贝数临界值: 不包括死亡时间 (月数)Log rank p0.001Ross JS, Fl

6、etcher JA. Stem Cells 1998; 16: 413428淋巴结阴性Seshadri R et al. J Clin Oncol 1993;11:1936421008060402000 12 24 36 48 60 72无病生存概率死亡时间 (月数)HER2 基因 3 拷贝数HER2基因 3 拷贝数对数秩检验 p=0.001淋巴结阳性 HER-2扩增患者无病生存期缩短2007 NCCN 治疗指南HER2检测的原则统计Ratio值（计数浸润性部分的30个细胞）HER2基因未扩增（ Ratio 1.8）多体性不扩增（ Ratio 2.2或排列呈簇状）多体性扩增（ Ratio 2.

7、2）HER2 基因检测结果示意图Her-2基因无扩增情况红信号数2，同时绿信号非整倍体R30%的肿瘤细胞全部的细胞膜高强度着色免疫组化（3+）与FISH对比 40100住院号：177319浸润性导管癌级IHC：+FISH：呈簇团状高度扩增100免疫组化（2+）与FISH对比30%的肿瘤细胞全部的细胞膜弱至中等着色40浸润性导管癌级IHC：+FISH：Ratio5，中度扩增100免疫组化（）与FISH扩增阳性浸润性导管癌级IHC：FISH：呈簇状扩增肿瘤细胞不着色40100我院已完成HER2检测1140病例小结推荐HER2检测流程FISH3+0/1+2+IHCFISH重新检测-+赫赛汀 治疗赫赛

8、汀 治疗-+赫赛汀 治疗肿瘤标本（石蜡包埋）FISH重新检测+消化系统肿瘤胃 癌 HER2 C-met FGFR2肠 癌 KRAS/BRAF/PIK3CA/PTEN MSI、MMR UGT1A1 15基因表达GIST C-KITPDGFRA肝癌 HBV-DNAHCV-RNA “老靶新用“靶向筛选遗传筛查化疗预测预后生存NCCN指南提及的与肠癌治疗相关的分子指标Fodde R, et al. Nature Rev Cancer 2001;1:556740%的CRC具有KRAS基因突变KRAS基因突变是CRC发生的早期事件BRAF丝/苏氨酸特异性激酶转导因子：RAS/RAF/MEK/ERK/MAP

9、K与KRAS不同时发生突变突变类型：90% exon15 T1799A V600E 10% exon11 甘氨酸环肠癌BRAF MT 10%BRAF MT 患者对抗EGFR治疗无效PFS、OS差PIK3CA在结直肠癌中，PI3K信号通路中PIK3CA基因突变率最高，在总体CRC人群占到15%，集中在9号(60-65%)和20号外显子(20-25%)。PIK3CA突变对抗EGFR单抗的预测作用，研究结果不一致PI3CK突变率低，与KRAS基因突变并不互相排斥，对抗EGFR单抗的疗效预测作用尚未应用于临床PTEN变异在结直肠癌患者中，PTEN基因突变占5%，在MSI-H人群中突变率更高。20%40

10、% 结直肠癌患者存在PTEN 缺失PTEN基因缺失往往和KRAS、BRAF和PI3K基因突变同时发生近年来，PTEN 蛋白表达与抗EGFR单抗的疗效的关系也得到广泛关注；PTEN 缺失对抗EGFR单抗的预测作用同样没有用于临床PRIME “RAS野生/突变”新定义RAS 突变患者数增加了12%的绝对值WT KRAS患者中，约20%患者存在NRAS突变，无法从加用帕尼单抗中获益Oliner KS, et al. 2013 ASCO Abstract 3511.外显子1外显子2外显子3外显子4NRAS外显子1外显子2外显子3外显子4KRAS1213596111714612135961117146外

11、显子1外显子15外显子16BRAF600PRIME 分子标志物分析：帕尼单抗+FOLFOX组RAS MT患者的生存结果不如FOLFOX组很可能，帕尼单抗在MT RAS患者中这一显著不利影响将促使其在说明书中增加相关警告Oliner KS, et al. 2013 ASCO Abstract 3511.MT：任何KRAS或NRAS外显子2,3和4突变HR = 1.25 p=0.04 HR= 1.31p=0.01 (n=276)(n=272)中位 (月)微卫星不稳定性（microsatellite instability, MSI）肠癌MSI分子标志物检测10-15%1%80+%FAP散发型微卫星

12、不稳定(Microsatellite Instability)染色体不稳定CIN (Chromosome Instability)HNPCC散发型 MSI(+)MMR 胚系突变 MLH1MSH2MSH6PMS215-20%2 to 5% MMR MLH1 启动区甲基 多年长80-85%APC, p53, DCC, kras, LOH,.APC 胚系突变 IHC法检测MMR蛋白状态PCR法检测肿瘤DNA MSI胃癌Her-2基因扩增亚组中位 OS (月)全部11.1 vs 13.8预先计划分析 IHC 0 / FISH+IHC 1+ / FISH+IHC 2+ / FISH+IHC 3+ / F

13、ISH+IHC 3+ / FISH7.2 vs 10.610.2 vs 8.710.8 vs 12.312.3 vs 17.917.7 vs 17.5探索性分析 IHC 0 or 1+ / FISH+IHC 2+ / FISH+ or IHC 3+8.7 vs 10.011.8 vs 16.0123450.921.240.750.580.830.48, 1.760.70, 2.200.51, 1.110.41, 0.810.20, 3.38HR95% CI 0.740.60, 0.911.070.650.70, 1.620.51, 0.83相对危险度倾向赫赛汀倾向无赫赛汀58

14、4617015925615131446N根据HER2状态进行的探索性疗效交互分析， p=0.0368van Cutsem E, et al. J Clin Oncol 2009; 27:Abstract 4509.HER2 状态对总生存期（OS）的影响IHC（Dako）抗体检测 HER2蛋白表达IHC 3+: 10% 的细胞中至强、完整的膜或基底侧 面膜着色FISHDNA 探针检测HER2基因扩增FISH+：HER2:CEP17 ratio 2HER2-阳性定义为： IHC 3+ 和/或 FISH+ToGA研究：HER2 检测手段0FISH+可接受赫赛汀治疗可接受赫赛汀胃癌治疗的欧盟标准+1+

15、2+3IHC肿瘤标本Herceptin EU SmPC: http:/www.ema.europa.eu/humandocs/PDFs/EPAR/Herceptin/emea-combined-h278en.pdf.肺癌化疗敏感预测?靶向药物敏感性EGFR突变（Seq等）EGFR扩增（FISH）ALK-EML4（FISH）ROS1（FISH）KIF5B-RET（FISH）靶向药物耐药性EGFR T790M（Seq等）C-met扩增（FISH）PTEN缺失（FISH）KRAS，BRAF，PIK3CA突变？MassARRAYWhole Genome Seq驱动基因筛查化疗敏感性非小细胞肺癌基因变异

16、类型常见基因变异类型基因突变融合基因基因扩增或缺失常用检测技术ALK-EML4， RET， ROS1融合基因, C-Met，EGFR，FGFR1扩增；PTEN缺失EGFR， KRAS， BRAF， PIK3CA，BIM缺失 定量PCR基因分型及定量荧光原位杂交（FISH）Sanger测序、高通量测序免疫组化技术非小细胞肺癌个体化治疗分类基础传统病理分型腺癌鳞状细胞癌大细胞癌基因分型EGFR Mut+BRAF MutKRAS Mut+PIK3CA Mut+ALK Fus+RET Fus+ROS1 Fus+MET Ampli+EGFR Ampli+FGFR Ampli+EGFR基因突变检测EGFR

17、 mutations in lung adenocarcinomaSharma, Nat Rev Cancer, 2007突变位点分布不同标本检测情况标本类型分布 （手术/穿刺/支气管镜/胸水） 标本类型例数成功检出阳性检出手术标本19491933（99.2%） 637（33.0%）活检或穿刺标本10921057（96.8%） 416（39.3%）胸水2020（100%）6 （30%）汇总30613000（98.0%） 1059（35.3%） 不同标本EGFR基因突变检出率356例NSCLC（腺癌）EGFR突变43个亚型检出率及分布野生型突变型检出例数169187比例169/356（47.47

18、%）187/356（52.5%）E18 G719XE19 DelE20 S768IE20 T790ME20 InsE21 L858R检出例数67641897比例6/18776/1874/1871/1878/18797/187百分比3.20%40.64%2.14%0.53%4.27%51.87%中国人群的EML4-ALK融合基因？Ros 1融合基因？RET融合基因？肺癌的分子靶向基因肺癌分子靶向基因的回顾和展望ALK融合基因的检测ROS1融合基因的检测RET融合基因的检测47Best tumor response to crizotinib by patient80604020020406080

19、100Change from baseline (%)PDPRSDCR30%1020304050607079SubjectKwak et al. New Engl J Med. 2010;363:169303ALK为肺癌亚型的分子标志物无EGFR和KRAS基因突变?腺癌病人非或极轻度吸烟者年轻 NSCLC肺癌中ALK阳性率约为3%-7%?每年有40,000例NSCLC肺癌病人ALK阳性肺癌亚型分子标记物ALK融合基因IHC法和2种FISH法检测结果ALK融合基因和临床病理参数的关系例数总病例 ALK阴性 ALK阳性 P Value病理类型(%)398364（91.5）34（8.5）腺癌308(

20、77.4)277(76.1)31(10)0.124鳞癌72(18.1)70(19.2)2(2.8)其他18(4.5)17(4.7)1(2.9)性别(%)男244(61.3)227(62.4)17(7)0.157女154(28.7)137(37.6)17(11)年龄（中位数/%）58215(54.0)192(52.7)23(11)0.09558183(46.0)172(47.3)11(6)分化类型高21（5.3）21（5.8）0（0.0）0.351中140（35.2）127（34.9）13（9.3）低237（59.5）216（59.3）21（8.9）临床分期(%)+ 184(46.2)174(4

21、7.8)10(5.4)0.040 +214(53.8)190(52.2)24(11.2)吸烟状况（%）不/曾吸烟233（58.5）206（56.6）27（11.6）0.010 吸烟165（41.5）158（43.4）7（4.2）EGFR检测(%)38134932EGFR阴性248(65.1)219(62.8)29(11.7)0.002EGFR阳性133(34.9)130(37.2)3(2.2)ALK融合基因的qRT-PCR法和测序法检测结果中国地区ALK-EML4融合基因阳性率QRT-PCR方法：12%测序法：9.4%EML4-ALK融合探针FISH法：8%Abott ALK分离探针FISH法

22、：5%肺癌的分子靶向基因肺癌分子靶向基因的回顾和展望ALK融合基因的检测ROS1融合基因的检测RET融合基因的检测NSCLC融合基因: ROS1基因文献报道NSCLC中ROS1基因重排阳性检测率为0.8%-1.7%多见于年轻，不/少吸烟，腺癌和其他融合基因无重叠ROS1基因重排可引起癌基因ROS1融合激酶的表达及对ROS抑制剂敏感性靶向药物Crizotinib对ROS1基因重排有效常见融合类型（8个基因11个亚型）基因类型TPM3-ROS1TPM3 exon 10:ROS1 exon 35SDC4-ROS1 SDC4 exon 2:ROS1 exon 32SDC4-ROS1 SDC4 exon

23、 4:ROS1 exon 32SDC4-ROS1 SDC4 exon 4:ROS1 exon 34SLC34A2-ROS1SLC34A2 exon 13:ROS1 exon 32CD74-ROS1 CD74 exon 6:ROS1 exon 32CD74-ROS1 CD74 exon 6:ROS1 exon 34 EZR-ROS1 EZR exon 10:ROS1 exon 34LRIG3-ROS1 LRIG3 exon 17:ROS1 exon 35CCDC6-ROS1 CCDC6 exon 6:ROS1 exon 34GOPC-ROS1 GOPC exon 7:ROS1 exon 35RO

24、S1融合基因分子检测ROS1融合基因和临床病理参数的关系肺癌的分子靶向基因肺癌分子靶向基因的回顾和展望ALK融合基因的检测ROS1融合基因的检测RET融合基因的检测经验总结KIF5B-RET融合多国报道检出率0.8-2.0%都发生于肺腺癌主要见于非吸烟患者与其他驱动突变无交叉重叠目前无特异性RET-TKI常见融合类型（3个基因9种亚型）基因类型KIF5B-RETKIF5B exon 15:RET exon 12KIF5B exon 16:RET exon 12KIF5B exon 23:RET exon 12KIF5B exon 24:RET exon 8KIF5B exon 22:RET e

25、xon 12KIF5B exon 24:RET exon 11KIF5B exon 15:RET exon 11CCDC6-RETCCDC6 exon 1:RET exon 12NCOA4-RET NCOA4 exon 6:RET exon 12RET融合基因分子检测RET融合基因和临床病理参数的关系6%4%鼻咽癌EBV-DNA头颈鳞癌HPV甲状腺癌驱动基因BRAF、RET传统优势项目HPV检测新天地让好的更好一些头颈肿瘤血浆EBV-DNA定量分析在鼻咽癌临床工作中的应用（一）鼻咽癌诊断鼻咽癌病人血浆EBV-DNA阳性率为97%（282/299），正常对照人群阳性率为12%（18/160），鼻

26、咽癌治疗后阳性率为20% （39/120）。对初治鼻咽癌患者，血浆EBV-DNA对NPC诊断的敏感性为97，特异性为88%。 （二）鼻咽癌鉴别诊断62例鼻咽癌颈部淋巴结转移的病人血浆EBV-DNA阳性率为97%，中位浓度为24473拷贝/ml；80例非鼻咽癌颈部淋巴结转移癌病人阳性率为13%；中位浓度为0拷贝/ml；50例颈部淋巴结炎症病人阳性率为12%，中位拷贝为0拷贝/ml。血浆EBV-DNA定量检测在鼻咽癌临床应用总结血浆EBV-DNA测定对鼻咽癌的诊断和鉴别诊断不仅有高度敏感性（90%以上），特异性也强（不低于85%）。鼻咽癌临床TNM分期的发展与病人血浆EBV-DNA浓度呈显著正相关

27、，能较好反映肿瘤TNM分期的进展，可在分子水平补充传统临床分期的不足。鼻咽癌病人治疗后持续缓解的病人，如果血浆EBV-DNA浓度突然升高，预示肿瘤复发和转移可能性很大。鼻咽癌经治疗后血浆EBV-DNA快速转阴（约80%），因此治疗过程中动态观察血浆EBV-DNA水平能够协助评价治疗效果，对持续阳性的病人要采取进一步的治疗措施。治疗前血浆EBV-DNA水平高的病人较水平低的病人预后生存差。定量检测血浆EBV-DNA方法简便，无创伤性，应用前景好。分子诊断在软组织肉瘤诊断和分型中的应用最早发现的人类肿瘤遗传异常Ewings Sat(11;22)(q24;q12)CMLt(9;22)(q34;q11

28、.2)Aurias A, et al. N. Engl. J. Med. 309:496-497, 1983.Turc-Carel C, et al. N. Engl. J. Med. 309:497-498, 1983.Delattre O, et al. Nature 359:162-165, 1992.Nowell PC, et al. Science 123: 1497-1500, 1960.Rowley JD. Nature 243:290-203, 1973.Groffen J, et al. Cell 33:93-99, 1984.Ph Chromosome P. Nowell

29、, et al. JNCI 25:85-109 , 1960.Tumor typeCytogenetic TranslocationGenes involvedES/PNET促纤维圆细胞肿瘤骨外黏液样软骨肉瘤 透明细胞肉瘤腺泡状横纹肌肉瘤黏液样脂肪肉瘤滑膜肉瘤腺泡状软组织肉瘤隆突性皮肤纤维肉瘤低级别纤维黏液瘤血管瘤样 恶性) 纤维组织细胞瘤 先天性纤维肉瘤 (中胚层肾瘤)内膜样间质肉瘤炎性肌纤维母细胞瘤t(11;22) (q24;q12)t(21;22) (q22;q12)t(7;22) (p22;q12)t(2;22) (q33;q12)t(17;22) (q12;q12)inv(22)t(

30、16;21)(p11;q22) t(11;22) (p13;q12)t(9;22) (q22;q12)t(9;17) (q22;q11)t(9;15) (q22;q21)t(12;22) (q13;q12)t(2;22)(q33;q12) t(2;13) (q35;q14)t(1;13) (p36;q14)t(12;16) (q13;p11)t(12;22) (q13;q12)t(X;18) (p11;q11)t(X;17) (p11.2;q25)t(17;22) (q22;q13)t(7;16) (q32-34;p11)t(11;16)(p11;p11)t(2;22)(q33;q12)t(1

31、2;16) (p11;q13)t(16;22) (q13;q12)t(12;15) (p13;q25)t(7;17) (p15;q21)translocations at 2p23EWSR1-FLI1EWSR1-ERGEWSR1-ETV1EWSR1-FEVEWSR1-E1AFEWSR1-ZSGFUS-ERG EWSR1-WT1EWSR1-CHNRBP56-CHNCHN-TCF12EWSR1-ATF1EWSR1-CREB1 PAX3-FKHRPAX7-FKHRFUS(TLS)-CHOPEWSR1-CHOPSSX1-SYTSSX2-SYTASPL-TFE3COL1A1-PDGFBFUS-CREB3

32、L2FUS-CREB3L1EWSR1-CREB1FUS-ATF1EWSR1-ATF1ETV6-NTRK3JAZF1-JJAZ1ALK, multiple fusion partners软组织肉瘤特征性细胞遗传学改变一览Ewings 肉瘤/PNET诊断和鉴别诊断 临床特征好发于青年、长骨 胸壁软组织、椎旁、 腹膜后、肢端影像学特征 破坏性 parameative lesion involving 长骨骨干、骨盆、胸壁 病理学特征富含糖原的原始间叶细胞、菊形团结构超微结构特点：原始间叶细胞, 糖原沉淀、神经分化 分子遗传学特征t(11:22) (q24;q12), FLI-1-EWSR1融合; t

33、(21;22) (q24;q12), ERG-EWSR1融合; t(7;22) (p22;q12), ETV1-EWSR1融合Ewings Sarcoma融合基因PrototypicFISH技术 （融合探针）FLI-1 Probe (green)EWS/FLI-1 FusionEWS Probe (red)滑膜肉瘤诊断SYT（SS18）基因断裂检测滑膜肉瘤（Synovial Sarcoma, SS）临床特征好发于青年 占所有软组织肉瘤的5%-10% 好发于肢端 病理特征2种细胞形态：上皮细胞和梭形细胞亚型: (1)双向型, (2) 纤维型, (3) 上皮型 分子遗传你学特征t(X;18) (1

34、1.23; 11.2)易位; SYT-SSX1/SSX2融合基因形成SYT-SSX1 融合基因与蛋白SSXRDKRABControlSYT RearrangementGreenRedDual Color Break Apart SYT 18q11.2 ProbeACBA: 滑膜肉瘤B: 纤维肉瘤AB黏液样圆细胞型脂肪肉瘤(myxiodround cell liposarcoma，MRCL)脂肪肉瘤主要类型之一95%的MRCLs存在染色体易位t(12;16)(ql3;pl1)，形成FUS-CHOP融合基因脂肪肉瘤诊断CHOP基因断裂检测检测探针： LSICHOP Dual Color Break

35、-Apart Probe 无CHOP易位 有CHOP易位2个紧密相邻的红绿信号或叠加的部分呈黄色1对红绿信号分离1对红绿信号紧密相邻A: CHOP基因断裂，绿点呈散沙样B: CHOP基因断裂，2O2GC: CHOP基因无断裂A：MRCLB：MRCLB：高分化C：去分化分子诊断在淋巴瘤辅助诊断和分型的应用3号染色体bcl-6基因bcl-6bcl-6探针35断裂基因多拷贝杂交正 常 异 常结果观察与解读双色分离重排探针(bcl-6 BA）14（灰）号和18号（黑）染色体IgHBcl2IGH/BCL2探针IgH基因Bcl-2基因杂交正 常 异 常融合基因扩增结果观察与解读双色双融合易位探针( IGH

36、/BCL2）淋巴造血系统肿瘤预后评估个体化治疗治疗检测辅助诊断分类疾病名称检测项目白血病APLPML-RARa融合基因定性、定量ANLLAML1-ETO、MLL（11q23）5q-/-5，7q-/-7，+8，20q-，t（6；9），t（9；22），t（9；11），inv16/t(16;16)，Inv3/t(3;3)MLLBCR-Abl、t（12；21）TEL-AML1基因MLL（11q23）、IgH、TCR重排CMLBCR-AblCLL12，11q-，17p-，13q14.3/13q34淋巴瘤FL、MCL、MALT、BurkittIgH/BCL2、IgH/CCND1、IgH/MYC、IgH/M

37、ALTDLBCLBCL6ALCLALK浆细胞疾病 MMt（11；14），t（4；14），t（14；16），RB1（13q14），17p-骨髓增生疾病MPNJAK2-V617F基因突变、JAK2基因exon12、13突变MDS5q-/-5，7q-/-7，+8，20q-淋巴瘤类型染色体易位发生频率涉及基因FLt（14；18）（q32；q21）90%IGH -BCL2t（3；14）（q27；q32）及变异型5-15%BCL6-IGHMCLt（11；14）（q13；q32）95%CCND1-IGHMALTt(11;18) (q21;q21)15-40%API2/MALT1 t(14;18)(q32；q

38、21)20%IGH-MALT1BLt（8；14）（q24；q32）85%MYC-IGHt（2；8）（p12；q24）10%IGK-MYCt（8；22）（q24；q11）5%MYC-IGLDLBCLt（14；18）（q32；q21）20-30%IGH-BCL2t（8；14）（q24；q32）10%MYC-IG （nonIG）t（3；14）（q27；q32）30%BCL6-IGH BL/DLBCLt（8 q24）35-50%MYC-nonIGt(14；18)(q32；q21)15%IGH-BCL2t（3 q27 ）？BCL6浆细胞瘤t(11；14)(q13；q3220-25%CCND1-IGHAL

39、K+ ACLCt（2；5）（p23；q35）及变异型100ALK -NPM 按淋巴瘤瘤种区分的染色体易位及相关基因 按染色体易位区分淋巴瘤瘤种 涉及基因淋巴瘤类型发生频率IGH -BCL2FL70%DLBCL20-30%BL/DLBCL15%CCND1-IGHMCL95%浆细胞瘤20-25%API2/MALTIGH/MALTMALT（胃）15-40%MALT（肺、眼、涎腺）20%IGH-MYCBL85%DLBCL10%BL/DLBCL5%BCL6DLBCL30%BL/DLBCL?ALKALK+ ACLC100不同类型的淋巴瘤染色体易位类型不同优点-适用于形态学上难以诊断且IHC结果不理想的标本

40、；-适用于细胞数量少，形态不典型的活检及穿刺组织。必须结合组织形态学和IHC结果作最后诊断！FISH检测染色体易位在淋巴瘤分型中的应用病例1：会诊84363，男，74y 腹腔肿物；FISH：54%的细胞可见融合信号； 诊断：FL-级。4401001040病例3: 399318，女、5y 颈淋巴结活检； ISH: EBERs（+）； FISH:45%的细胞可见融合信号； 诊断：散发性经典型BL。病例5:399625，男、42y ISH:EBERs（-）； 诊断：较符合散发性非典型BL； FISH: 25%的细胞可见融合信号； 440 活检穿刺标本1040IHC:CyclinD1病例6: 3933

41、01，男，40y； 肘部肿物； IHC：CyclinD1弱阳性； 经科内会诊； FISH:21%的细胞可见融合信号；所示箭头为染色体易位产生的融合信号（100）诊断：套细胞淋巴瘤 （MCL） 10CyclinD140病例7: 386766，女，67y 扁桃体活检2块，直径0.3CM IHC：CyclinD1弱阳性； FISH:45%的细胞可见融合信号；诊断：不排除MCL的可能，重取活检；形态不典型+IHC不理想所示箭头为染色体易位产生的融合信号（100）最后诊断：套细胞淋巴瘤基因重排原理- 在B 和T淋巴细胞分化过程中不断进行Ig和TCR基因重排。- 良性增生性淋巴细胞起源于多个克隆，基因重排

42、各式各样，PCR 扩增产物片段长短不一，序列不同，电泳见不到克隆性重排而呈弥漫分布的涂抹状。- 淋巴瘤是淋巴细胞某一分化阶段的恶性克隆性增生所致的肿瘤，为单克隆性，基因重排片段大小相同，PCR产物在特定的基因片段范围内电泳呈一窄带。 510%的疑难病例； 一些可疑的B细胞增生，而形态学和免疫表型不能 排除恶性病变时； 所有可疑的T细胞增生（需要特别注意的是：T细胞丰富的B-NHL）；鉴定一个病人中的两个淋巴恶性的克隆关系或区分是复发或新发肿瘤。哪些需要进行基因重排的检测？以 IGH (VHJH) 重排为例.示例：左肾下极肿物DLBCL（非GCB亚型）IGH/BCL2(+)IGH/CMYC(-)

43、BCL6无断裂IGA重排（+）IGA重排（+）IGH/BCL2分子诊断在少突胶质细胞瘤诊断中的应用 分类检测项目检测目标适用技术特色检测预后及分子分型1p19qLOHFISHIDH1/2基因多态性DHPLC / 测序EGFRvIIImRNA表达RT-PCR免疫治疗BRAF融合基因mRNA表达个体化治疗常规化疗药物铂类ERCC1mRNA表达/蛋白表达QPCRBRCA1LRP依托泊苷TOP2A长春新碱-tubulin 铂类XRCC1基因多态性DHPLC/测序5-Fu类TYMS伊立替康UGT1A1甲氨蝶呤TPMT卡莫司汀MGMT甲基化MSP+DHPLC替莫唑胺靶向药物贝伐单抗VEGFR1,2mRNA

44、表达/蛋白表达QPCRVEGFICAM1ELISAEGFR-TKIsEGFRvIII基因突变DHPLC / 测序K-rasPTENLOHFISH2、全面把握胶质瘤 生物遗传特性辅助病理诊断的分子检测意义二代测序技术在肿瘤个体化诊疗中的应用Next Generation Sequencing in Personalized Cancer Treatment邵建永中山大学肿瘤医院分子诊断科2015.09 南宁第一部分 肿瘤基因组学及二代测序技术背景遗传学发展里程碑肿瘤研究的转折点：人类基因组测序杜尔贝克 （Renato Dulbecco）肿瘤病毒学家1975年获诺贝尔生理学和医学奖“A missi

45、on impossible!”“我们永远不可能知道人类基因组序列 我可以保证，300年内不可能知道”！111想更多地了解肿瘤，我们从现在起必须 关注细胞的基因组。两种选择：要么通过零敲碎打的方法发现导致癌症的基因，要么去测定整个人类基因组序列。肿瘤研究将因对DNA的详细知识而得到巨大推动。国际肿瘤基因组计划: 目标全面解析所有重要肿瘤类型的遗传基础鉴定所有重要肿瘤类型的基因组、转录组和表观基因组变异图谱113TCGA: “各平台齐头并进，各显神通”25 种癌症胶质母细胞瘤 (脑)鳞状细胞癌(肺)浆液性囊腺癌(卵巢)等等多种数据类型1临床诊断治疗史组织学诊断病理学报告和图像组织解剖部位外科手术史

46、基因表达/RNA测序染色体拷贝数杂合性丧失甲基化方式miRNA 表达DNA 测序RPPA (蛋白)多类型样本的分型多于150个组织采取点的生物标本核心资源库6个癌症基因组研究中心3个基因组测序中心7 基因组数据分析中心数据协调中心113实现产业转化时间：核能30年，卫星20年，基因15年？1945美国中国落后19年1969美苏中国落后20年1999 人类基因组计划 中国与强国同步二十世纪人类三大科学创举DNA变异检测分析：全基因组测序 (Whole genome Resequencing)外显子测序 (Exome-seq)个性化目标区域测序 (Target region seq) 二代测序技术

47、115116(Meyerson et.al, nature reviews genetics,2010)Point mutations (nucleotide substitutions)Small coding insertions/deletions (indels)Copy number alterations (CNAs)Chromosomal rearrangements体细胞DNA变异检测RNA表达分析（RNA-sequencing）转录组测序 (Transcriptome seq)表达谱测序 (Expression profile)小RNA测序 (miRNA seq)长非编码RN

48、A测序 (lncRNA seq)二代测序技术117表观调控分析技术：DNA甲基化 全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS) 甲基化 DNA 免疫共沉淀测序(MeDIP-seq) 基于双酶切消化的重亚硫酸盐测序(dRRBS)DNA羟甲基化HMST-Seq羟甲基化 DNA 免疫共沉淀测序RNA甲基化组蛋白修饰 染色质免疫共沉淀测序(ChIP-Seq)二代测序技术118二代测序原理边合成边测序（sequencing by synthesis）鸟枪法（shotgun）仅供医药卫生专业人士参考120测序价格（每百万个碱基）变化趋势商品化二代测序平台的问世和升级带来了测序价格的显著下降。目前，一个人类全基因组的

49、测序成本（非高质量商品化测序服务售价）已低至1000美元。仅供医药卫生专业人士参考第二部分二代测序技术在肿瘤临床诊疗的应用肿瘤基因组研究进入大数据时代癌症药物治疗现状：化疗+靶向基因检测能够有效预测药物疗效及毒副作用常用二代测序平台能检测哪些生物标志物? 服务于药物研发和个性化医疗全基因组测序外显子组测序RNA测序基因序列基因拷贝数基因组结构融合转录本RNA拷贝数RNA序列基因融合(gene fusion)拷贝数变异(CNV)等位基因表达(Allelic expression)基因突变(SNPs, indels)药物研发：the story of vemurafenibNature 2002;

50、417:94954从高通量全基因组数据中筛选与恶性黑色素瘤相关的生物标志物结合分析其他利用低通量技术获得的相关生物标志物研究成果生物信息学统计发现：66%的恶性黑色素瘤中发现BRAF错义体突变，其中的80%是V600E点突变Nature 2010;467:5969N. Engl. J. Med 2010;363:80919成功合成突变型BRAF(V600E) 的靶向抑制剂PLX4032Phase I clinical trial2011年8月17日，Vemurafenib获得FDA批准，用于治疗晚期黑色素瘤。“vemurafenib”的名字来自于“V600Emutated BRAFinhibi

51、tion”细胞实验发现：突变型BRAF(V600E)蛋白表现出更高的激酶活性Cancer Res 2005;65:2412-21动物模型发现：表达突变型BRAF(V600E) 的恶性黑色素瘤表现出更强的血管生成能力和瘤体生长速度基因突变频率研究蛋白功能研究靶向药物合成临床实验玛格丽特公主癌症中心麻省总医院达纳-法伯癌症研究所安德森癌症中心范德比尔特-英格拉姆癌症密歇根大学综合癌症中心纪念斯隆-凯特林癌症中心梅奥诊所癌症中心古斯塔夫鲁西研究所法国国家癌症研究所英国癌症研究院荷兰个体化癌症治疗中心挪威全国计划瑞典隆德大学全世界国家级机构对实体瘤的基因筛查策略及平台 肿瘤个体化治疗基因检测 （508

52、基因） 细胞生存 细胞凋亡 基因组稳定性 MAPK信号 RTK信号 PI3K信号 STAT信号 TGF信号 细胞周期/凋亡 HH信号 APC信号 NOTCH信号 转录调节 染色质修饰 DNA损伤控制 肺癌 TP53 EGFR MLL3 CDKN2A MLL2 NF1 STK11 SMARCA4 SETBP1 ATRX CREBBP KDR ATM KRAS KEAP1 MALAT1 CRIPAK - EPHB6 EPHA3 乳腺癌 PIK3CA TP53 GATA3 MAP3K1 CDH1 MLL3 MAP2K4 PTEN RUNX1 AKT1 PIK3R1 TBX3 MALAT1 CBFB

53、FOXA1 CTCF NCOR1 - CDKN1B RB1 NF1 其他实体瘤 AJUBA ARFRP1 B4GALT3 BACH1 BAK1 BCL2 BCL2A1 BCL2L1 BCL2L11 BCL2L2 BCL6 BCORL1 BCR BLM BTG1 BTK C11orf30 - C1R C1S CBL 结直肠癌 APC TP53 KRAS PIK3CA FBXW7 NRAS SMAD4 SMAD2 BRAF CTNNB1 MLL4 PTCH1 RB1 CDH1 PTCH1 ARID1A MLL2 - 化疗药物 靶向药物 药物靶点基因 28种临床期靶药 TP53 TPMT ERCC2

54、 XPC XRCC1 GSTP1 ABCB1 ERCC1 ABCC4 MTHFR CYP1B1 ABCC1 ABCC2 DPYD - EGFR KRAS NRAS BRAF ALK ROS1 KIT PDGFRA MET RET ERBB2 PIK3CA PTEN AKT1 - ABL2 AKT2 AKT3 AURKB CDK6 CHEK1 JAK3 IGF1R MDM2 MDM4 NOTCH1 PIK3R1 MEN1 SRSF2 - 33种FDA批准靶药 27种化疗药物 癌症相关12条通路所有实体瘤88种抗癌药物 检测技术检测内容检测优势样本类型 适用人群检测508个基因外显子序列解读88种

55、肿瘤药物目标区域捕获+高通量测序可检测5%以上的突变灵敏度：99%特异性：99%肿瘤组织：新鲜组织穿刺样本，石蜡切片对照：外周血肿瘤患者肿瘤个体化检测介绍肿瘤个体化基因检测1. 依据分子靶点的个体化医疗各瘤种相对应的 体细胞突变 染色体重排 小片段插入/缺失 遗传性突变132基于单基因、单位点检测已不能满足个体化治疗的需求，基于二代测序技术的多靶点基因检测是未来个体化治疗的趋势。示例1：NSCLCJAMA. 2014;311(19):1998-2006. doi:10.1001/jama.2014.3741. 强烈推荐广泛的分子标记物的筛选以寻找有效药物 Nat. Rev. Clin. Onc

56、ol. advance online publication 21 July 2015 示例2：转移性乳腺癌精准医疗的难点及解决办法2条解决途径乳腺癌靶向基因组变异Growth factor receptorsHER2, FGFR, IGFR, EGFR inhibitor PI3K/AKT/mTORPI3K inhibitor, AKT inhibitorMEK pathwayMEK inhibitorJNK pathwayCell cycleCDK4 inhibitorDNA repairPARP, MDM2 inhibitorER signallingEndocrine therapyE

57、pigeneticsDrug targeting epigeneticsNOTCH3NOTCH inhibitor甲状腺结节FN样本分子检测及相关癌症风险甲状腺结节细针穿刺样本分子检测及筛查流程2. 基因组测序技术在血浆循环肿瘤DNA检测的应用外周血循环肿瘤DNA检测ctDNA方法学液体活检的应用J Clin Oncol 32:579-586.外周血循环肿瘤DNA在不同肿瘤的检测频率Nat Med. 2014, 20(5):548NSCLC ctDNA的深度测序 肿瘤特异DNA突变的检测 EGFR单抗的药效监测 治疗过程中多个耐药克隆的出现mCRC靶向药物ctDNA突变监测 3.遗传性肿瘤基因

58、检测144癌症分为散发性癌，家族性癌和遗传性癌5-10%的肿瘤是遗传-遗传特定基因的突变个体发生肿瘤的风险会增加。加强管理，指导患者及亲属的癌症防治肿瘤遗传易感基因检测临床管理145 遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征 (Hereditary breast ovarian cancer syndrome, HBOC)HBOC：指一个家族中有2 个一级亲属或 1 个一级亲属和 1 个二级亲属患乳腺癌或卵巢癌，并具有遗传倾向。 常染色体显性遗传HBOC检测NCCN指南基因基因功能易感性意义BRCA1BRCA1相关蛋白复合物高外显率全外显子及外显子与内含子交接10bp，不包括拷贝数改变及大片段缺失胚系突变B

59、RCA2Fanconi/BRCA高外显率PALB2Fanconi/BRCA中外显率BARD1BRCA1相关蛋白复合物中-低外显率BRIP1Fanconi/BRCA中外显率RAD51CFanconi/BRCA中外显率CHEK2DNA双链断裂修复中外显率RAD50DNA双链断裂修复中外显率MRE11ADNA双链断裂修复中-低外显率NBNDNA双链断裂修复中-低外显率ATMDNA双链断裂修复中外显率MRE11ADNA双链断裂修复中-低外显率CDH1细胞粘附高外显率TP53细胞生长高外显率PTENPI3K/MAPK 信号通路高外显率MUTYHDNA修复中-低外显率MLH1错配修复基因MSH2错配修复基

60、因MSH6错配修复基因PMS1错配修复基因PMS2错配修复基因148注：红色标注后面空格位置表示删除该点的readsSanger 验证CDS区发现了3种变异。与现有数据库比对，BRCA2两个突变与疾病意义不明确。BRCA1中的变异导致BRCA基因编码框截断，如图红色部分。整个编码区在第117氨基酸处终止MDLSALAVEEVQNVINAMQKILECPICLELIKEPVSTKCDHIFCKFCMLKLLNQKKGPSQCPLCKNDITKASLQESTAFSQLVEELLKIICAFQLDTGLEYANSYNFAKKEITLLNIXMDLSALAVEEVQNVINAMQKILECPICLEL