病毒性疾病防治挑战与我们的对策

1、病毒性疾病防治挑战与我们的对策Prevention and treatment of viral diseases Challenge and countermeasure通过前边讲课和讨论大家了解到，病毒结构简单，就是核酸外边包裹一层蛋白一壳，有些病毒最外还有包膜。但病毒与宿主之间的相互作用过程却很复杂，可造成宿主的各种类型感染。而且病毒的感染非常普遍，常可引起动物、植物和人类的各种疾病，并造成危害。这里主要以人类为例说明：在急性传染病中，绝大多数是由病毒引起占 70 802病毒性传染病发病率很高：据估计，每人一生中平均有200 次以上的病毒感染。3很多病毒病危害大，例如汉坦病毒引起的流行性

2、出血热，在我国每年造成数千人死亡；乙型脑炎病毒感染后可造成后遗症；风疹病毒、CMV感染胎儿可造成死胎或先天畸形。japaneseencephalitisvirus-乙型脑炎有意识障碍、痴呆、失语、瘫痪等严重后遗症 sequela ，以致造成终身残疾。4) some viruses -tumor5 新的病毒病不断出现：Ebola virus1976 首度於非洲的薩伊北部被發現, 1995年，於薩伊南部再次爆發大規模感染 , 刚果共和国以前称为扎伊尔埃博拉河畔的所有村庄中有430 人死于这一最奇异的方式( Ebola VirusHemorrhagic Fever)HIV 1980sAIDS2002

3、-2003SARSAvian Influenza swine Influenza2021 年 蜱叮咬传播的新型布尼亚病毒在我国河南等地造成上千人死亡由于病毒性疾病流行广，危害大， 因此病毒性疾病的预防和治疗一直是重要的课题，通过长期的努力取得了很大成功，但仍有很多问题尚未解决。一、治疗方面：Aspect oftreatment自从抗生素的创造和广泛应用以来， 治疗细菌性疾病取得了巨大成功， 人们试图也曾想通过创造抗病毒药的方法来治疗病毒性疾病， 从而有效控制病毒感染。 通过几十年的努力研制出了一些对病毒性疾病有效的药物，下面介绍几种具有里程碑性的抗病毒药物。第一个抗病毒药物是在 1962 年一

4、个叫碘苷的药物， 用於抗疱疹 ?结构与胸腺嘧啶核苷相似， 磷酸化后， 与去氧尿嘧啶核苷酸竞争磷酸化酶和 DNA 多聚酶， 从而抑制病毒DNA的 合成； 对 RNA 病毒无效?还可取代胸腺嘧啶核苷掺入病毒 DNA， 导致错误编码， 干扰 DNA 病毒的复制。?脱氧碘化尿嘧啶核苷?竞争性抑制胸苷酸合成酶，阻止局部用于疱疹型浅层上皮角膜炎DNA合成同年也出现一个金刚烷胺也是抗流感病毒的，它的作用在流感病毒一个叫M2， M2的一个离子蛋白上，它是它的抑制剂，选择性作用于包膜蛋白M2，阻断该蛋白的通道功能， 从而抑制病毒的复制过程。即干扰病毒进入细胞，抑制病毒脱壳及核酸的释放。特异性抑制甲型流感病毒；用

5、于甲型流感的预防1966 年批准上市，是第一个上市的抗流感药物。1976 年出现了一个， 就是广谱抗病毒药物就是干扰素，干扰素在1976 年美国 FDA批准上市。作为一个广谱抗病毒的药物1982 年无环鸟苷是第一个发现特异性的抗病毒酶的抑制剂。它的毒性很低，可以很有效地抑制疱疹病毒作用机制2- 脱氧鸟苷类似物在感染细胞中经病毒的胸苷激酶 TK及宿主细胞的激酶催化，生成阿昔洛韦三磷酸，抑制病毒 DNA多聚酶， 又可掺入病毒正在延长的DNA 中，阻断病毒DNA合成。艾滋病发生以后，出现了第一个抗艾滋病的，抗它的逆向转录酶的药物叫AZT齐多夫定， 在 1986 年美国第一次使用了这个药物，这是第一个

6、抗逆向转录酶的抑制剂用於艾滋病人治疗。?作用机制AZT 经细胞内 TK和胸苷酸激酶作用而磷酸化为三磷酸盐，竞争性抑制 HI V 逆转录酶， 并掺入到正在合成过程中的单链中， 终止病毒 DNA 链的延伸作用对 HI V 病毒、哺乳类和鸟类的其它逆转录病毒均有抑制作用。 用途联合用药疗法治疗 HI V 感染的不同病期的患者，善病人的临床病症，使病毒转阴， 生存期延长。如 齐多夫定、拉米夫定和阿波卡韦合用；齐多夫定、拉米夫定和蛋白酶抑制剂合用在 1990 年出现了第一个抗艾滋病的蛋白酶抑制剂叫沙奎拉韦，这个药在1996 年和其它的抗逆向转录酶的药联合使用，就是我们大家知道的鸡尾酒疗法，有效地控制了艾

7、滋病的病情。在国外，在美国和西方和其它兴旺国家控制了艾滋病的母婴传播率大大下降，死亡率大大下降， 病程延长， 所以这是一个很有效的工作，这个工作实际上是很出色的。这两种药都作用在两个病毒的特异性的酶上， 所以它对这个病毒有特异性的抑制剂作用，也算是医学上的一个范例，把艾滋病控制在一个相当低的水平，美国这方面做得很出色。在 1999 年的时候，同时出现了两个抗流感病毒的药物，一个叫做扎拉米韦中文名字，还有一个叫奥赛米韦。那这两个药物呢，它的作用是作用在神经氨酸酶，流感病毒神经氨酸酶上头，这也是一个特异性比拟高的药物。这是 40 多年来， 抗病毒药物的主要历史的进程，从这些药物研发的历史看，在艾滋

8、病发生以后， 抗病毒药物的研发特别地得到重视。所以现在抗艾滋病药物上市了以后，有十七、 八种已经用在临床。所以这类药物，实际上把抗病毒药物的研究推到一个高潮。InfectionAntiviral drugsHerpes simplexVaricella-Zosteracyclovir, valacyclovir万乃洛韦acyclovir, valacyclovirCytomegaloviirus (CMV)ganclclovir,更昔洛韦 , 丙氧鸟苷 foscarnet膦甲酸钠AIDSZidovudine,齐多夫定lamivudine (3TC), protease inhibitors;

9、incombination无环苷类药物主要有阿昔洛韦、更昔洛韦干扰素的发现:1957 年，英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研究人员JeanLindenmann ，在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，后者作用于其他细胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素。1966 1971 年，Friedman 发现了干扰素的抗病毒机制，引起了人们对干扰素抗病毒作用的关注，而后，干扰素的免疫调控及抗病毒作用、抗增殖作用以及抗肿瘤作用逐渐被人们认识科学家发现干扰素。干扰素是一种人体内自然产生的抵抗细菌和病毒的物质，是机体对病毒感染的重要防御系统，它与人体其他免

10、疫系统一起，共同担负着抵御病毒感染的任务。干扰素可通过加强人体自然杀伤细胞的活性，刺激巨噬细胞产生细胞因子，增强人体的细胞免疫功能，杀死病毒；还可以诱导细胞内产生抗病毒蛋白，抑制病毒的制。但为什么每年还有许多人死于病毒性疾病呢？因为有些病毒，如艾滋病病毒、乙肝病毒和 丙肝 病毒等，可以破坏人体天然干扰素，击毁人体的免疫监视系统。因此， 单单指望人体自身产生的天然干扰素，并不能控制有些病毒所造成的感染和疾病。1976 年 Greenberg 等首先报道用人白细胞干扰素治疗4 例慢性活动性乙肝，治疗后有 2 例 HBeAg消失。但是由于人白细胞干扰素原材料来源有限，价格昂贵，因此未能大量应用于临床

11、。发现干扰素后近 30 年的时间里，人们只能从大量人血液中提取微量干扰素，本钱非常高，那时人们不可能用干扰素治疗疾病。直到 1986 年，人们采用基因工程的方法( 用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素)Gene Engineering-IFNE.coliyeast，才实现了干扰素的大批量生产。自1991 年起，干扰素开始用于乙型和丙型肝炎的治疗，并取得了较好效果。长效干扰素half-life干扰素是治疗慢性乙型肝炎或慢性丙型肝炎的首选治疗，可以有效地抑制或去除病毒，疗效持久，阻止肝硬化或肝癌的发生。但普通干扰素治疗具有自身不可克服的缺点，半衰期短，只有4 个小时，就是说如果今天注

12、射了干扰素，第二天体内的干扰素就完全去除了。所以，干扰素不得不每隔一天就注射一次，使用很不方便。另一方面，当体内的干扰素去除后，体内的病毒又重新复制，不能持久地抑制病毒。为了克服普通干扰素的缺点，1990 年初，美国著名的干扰素研究机构，先灵葆雅公司研究所SPRI开始进行长效干扰素-2b 的研发。目的是改善普通干扰素-2b 半衰期短的特性。普通过干扰素半衰期短的原因，一是大量干扰素由于分子太小，通过肾脏 “漏了出去， 通过尿液排出体外，另一个原因是被免疫系统去除。聚乙二醇是一种惰性、易溶于水、可以做成任意大小的物质，普通干扰素经过它的“改造后，分子就会变大，不能或很少由肾脏“漏出，到达了延长在

13、体内存在时间的目的。普通干扰素-2b 的半衰期只有4 个小时，而经过聚乙二醇化的干扰素-2b 的半衰期达40 个小时，所以，聚乙二醇干扰素又叫长效干扰素。聚乙二醇化后，干扰素与受体的结合可能受到影响，使它的活性下降，而这种影响的大小取决于聚乙二醇分子的大小，聚乙二醇的分子越大，影响就越大。经过多年反复的研究，最终确定12KD 分子大小的聚乙二醇是最理想的，它在延长半衰期的同时，对干扰素活性的影响最小，既保证了一周一次给药，又最大程度地保存其抗病毒活性，这种新型的干扰素换代产品就是长效干扰素-2b 。新型的干扰素长效干扰素-2b 的半衰期为40 个小时， 可以在体内持续作用168 小时， 刚好满

14、足一周一次给药。长效干扰素-2b 保存了 30%的肾脏去除率，这样，当干扰素治疗期间发生严重不良反响时，撤药快速，便于对干扰素不易耐受的病人调整剂量，大大提高了长效干扰素治疗的平安性。抗病毒药必须对细胞内病毒具有高度选择性，而对宿主细胞无明显毒害，才能真正具有临床实用价值。近年来已研制出有选择性作用、而对人体低毒或无毒的药物。抗病毒药物很多， 除介绍的病毒灵、阿昔洛维外，还有疱疹净、金刚胺、穿心莲、板蓝根等。病毒对抗菌素不敏感，因此，病毒感染性疾病不要滥用抗菌素抗病毒药物研制和使用存在的问题现在所有这些抗病毒药不能去除、根治病毒，只能抑制病毒病毒生长受到抑制。和抗菌素的开展相比，抗病毒药物开展

15、得很缓慢。其原因在于 1病毒是细胞内寄生物它在细胞里生活，它跟细胞同样在生活，所以你很难找到一个药物把这个病毒杀死，而不把它这个细胞杀死，这是一个很主要的原因。Integrationinto hostcellDNA病毒药还有很多的困难，一个就是说病毒要整合，有些病毒是整合到细胞里去，所以它很难，现在还没有药物能够把整合的病毒拿出来。还有一种就是病毒它在静息期细胞，就是在 G0细胞里生长 , 所以这种细胞呢,Grow slowly in G0 cellstate 它里边药物浓度很低，所以病毒被保护了还有就是病毒会发生变异，drug resistancemutations病毒在变异的时候产生耐药性

16、,包括抗原漂移和抗原转变，如果这个变异很小的话，一个点或者两个点的变异，它可能给我们带来的影响就是对药物产生耐药thelackof relevantanimal 、cell models另外一个原因呢就是很多病毒都没有模型动物模型甚至是适宜的体外细胞模型。toxicity testdifficultpharmacodynamicsobstructdrugsresearchanddevelopment二、预防方面Aspect of prevention天花曾经是对人类危害极大的传染病，死亡率高，而且留有后遗症。由天花病毒引起，天花病毒属 痘病毒 科，Poxviridae 病毒中最大的一类 ，病毒

17、粒呈砖形或椭圆形， 大小 300 450纳米 170 260纳米，天花是一种烈性传染病感染，无药可治，病死率为 20-40%，患者在痊愈后脸上会留有麻子， “天花由此得名。痘病毒 Poxviuses 痘病毒 科，学名Poxviridae 病毒粒最大的一类DNA病毒 病毒粒呈砖形或椭圆形，大小300 450纳米 170260纳米我国古代接种人痘的方法有四种：痘衣法：把 天花病人的衣服或涂有天花脓疱浆的衣服给小儿穿。痘浆法：用棉花蘸天花脓疱液塞入儿童鼻孔。旱苗法：先将天花痂皮阴干研细，而后用银管吹入鼻孔。水苗法：将天花痂皮研细用水调湿，以棉花蘸染塞入鼻孔。人痘接种：实际上是人为地选择毒性小的天花病

18、毒在人体内造成一次轻型天花感染，因此难免有一定危险。接种后轻那么留下大块疤痕，重那么会导致死亡，有的还可能成为新的传染源。18 世纪英国乡村医生琴纳也发现接触牛痘病牛的挤牛奶女工不会患“天花，于是他改良了接种方法并取得了人体试验的成功。由此开始，疫苗学vaccinologywas born诞生了。Edward Jenner developed a smallpox vaccine in 179619世纪巴斯德研制出了狂犬病毒的疫苗狂犬病由狂犬病病毒引起 ， 主要通过病犬咬伤传播，人被咬伤后发病率约50%，发病后死亡率近100%巴斯德并不知道狂犬病是一种病毒 病，但从科学实践中他知道有侵染性的物

19、质经过反复传代和枯燥，会减少其毒性。他将含有病原的狂犬病的延髓提取液屡次注射兔子后，再将这些减毒的液体注射狗，以后狗就能抵抗正常强度的狂犬病毒的侵染。1885 年人们把一个被疯狗咬得很厉害的9岁男孩Joseph Meister送到巴斯德那里请求抢救， 巴斯德犹豫了一会后，就给这个孩子注射了毒性减到很低的上述提取液，然后再逐渐用毒性较强的提取液注射。巴斯德的想法是希望在狂犬病的潜伏期过去之前，使他产生抵抗力。结果巴斯德成功了，孩子得救了( 巴斯德研究所的看门人) 。Edward Jenner developed a smallpox vaccine in 1796. 1885: Louis Pa

20、steur rabies vaccine animal vaccines近代modern timesthe present day现代1954: Jonas Salk develops a killed polio virus 1961: Alfred Sabin develops an oral polio vaccine史上最著名的一位脊髓灰质炎 病人莫过于富兰克林罗斯福。1921年的夏天，他在一次游泳之后染上了脊髓灰质炎，最终造成了下肢瘫痪。1938年罗斯福建立了小儿麻痹症全国基金会，用于救治脊髓灰质炎患者，并促进疫苗的研制。在基金会的扶持下，Jonas Salk医生用了近 9年的时间，

21、于 1953年成功研制出第一个成功的脊髓灰质炎疫苗，这是继天花疫苗、 白喉 疫苗和 流感疫苗 后，疫苗研究的又一次重大突破。这种疫苗是一种灭活疫苗IPV，即把病毒杀死后制备成注射使用的疫苗。Jonas Salk也在自己、妻子和孩子身上进行了接种实验，结果他们体内出现了相应的抗体，并且没有患上脊髓灰质炎。这种疫苗保护儿童免受脊髓灰质炎侵害的有效率在80%到 90%左右。随后的很长的一段时间，这种疫苗成为了对脊髓灰质炎标准的预防手段。IPV疫苗效果很好，但还不是足够好，它还不能有效阻断病毒的传播。在20世纪 50年代，辛辛那提大学的Albert Sabin同样也在小儿麻痹症全国基金会的支持下进行疫

22、苗的研究。与IPV不同， Albert Sabin把脊髓灰质炎病毒在猴子的肾脏细胞、Vero细胞及人二倍体成纤维细胞中一代又一代的培养，直到筛选出致病力较弱的毒株。得到的疫苗称为口服减毒脊髓灰质炎疫苗OPV。这种疫苗取得了巨大成功，Albert Sabin的研究小组也因此获得了1965 年诺贝尔 医学奖。1954 年，JohnEnders，ThomasWeller 和 FrederickRobbins被授与诺贝尔生理学或医学奖， 以表彰他们发现脊髓灰质炎病毒能在各种组织培养中增殖。这一发现首次为生产灭活和活的脊髓灰质炎疫苗提供了时机。通过调查过去密封的诺贝尔委员会档案文件，我们回忆了那些获奖的

23、审议。看来SvenGard一位 Karolins ka 学会病毒研究的教授，当时是诺贝尔委员会的会员在那次获奖评审中起了举足轻重的作用。 Gard 说服该机构的教师学会不遵循诺贝尔委员会把诺贝尔奖授予 VincentduVigneaud的推荐。1954 年诺贝尔奖的另一个特点是Weller和 Robbins 的获奖仅仅根据那一年第一次提交的提名。 Gard在他的诺贝尔奖授奖仪式讲话中提到那项发现对今后生产疫苗的重要作用， 但更强调了培养许多医学上重要的各种病毒的含意。我们只能推测为什么后来提名的科学家如JonasSalk ，HilaryKoprowski，AlbertSabin 在创造脊髓灰质

24、炎菌苗的过程中有辉煌的奉献没有获得诺贝尔奖金。20世纪 30年-80 代随着病毒体外细胞培养的开展，相继出现了灭活疫苗和减毒活疫苗，进入了疫苗的多产时期，不少病毒如脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒等疫苗纷纷问世，有效的 控制了一些病毒病的发病率，1980 年5月 28日WHO宣布全球消灭天花病毒；脊髓灰质炎、麻疹病毒也有消灭的希望， 2000年10月29日在西太平洋地区已经消灭了脊髓灰质炎病例，同时风疹1969年风疹疫苗问世 、腮腺炎 1966年，流行性 腮腺炎疫苗问世、1963年麻疹 狂犬病的发病也下降到极低水平。Vaccines - Problems但是对很多病毒，疫苗的研制仍存在诸多问题有些病毒

25、柯萨奇、埃可病毒，腺病毒型别多，各型间无交叉免疫, 使疫苗研制使用难于操作有些病毒外表抗原容易发生变异流感病毒、轮状病毒即抗原漂移点突变和抗原转变 大片段的改变 有些病毒的核酸可整合到细胞的染色体上乙型肝炎病毒、HIV等有些病毒的潜伏感染这种潜伏状态的病毒半衰期极长，可达几十年。潜伏感染的细胞膜上没有病毒蛋白表达，免疫系统很难识别HBV , HIV 新现病毒感染SARS有些缺少适宜的动物模型使实验研究困难(HIV)? ? Transmission from cell to cell via syncytia?Recombination of the virulent strain or of

26、the vaccine virusNew Treatment Strategies新的治疗策略：RNAi 技 术 ribozyme technique 核酶Ribozyme 是 80 年代初期发现的具有催化功能的RNA分子。它具有高度专一内切核酸酶的活性。经过科学家十多年的研究，核酶已被开展成为一项新型技术并广泛应用动植物抗病， 人类疾病防治等领域的研究，显示出了广阔的应用前景。由于核酶具有专一的核酸内切酶活性及解离后重复切割相同靶分子的能力，核酶很快就被用来抑制病毒繁殖。最近几年， HIV-1 序列常被用作核酶攻击的靶序列来研究，研究频率要远远超过其他病毒，因此， 这就使得HIV-1 成为了

27、抗病毒核酶研究中一个典型的研究例子， 至今为止， 几乎所有HIV-1 的功能片断都用核酶切割过，包括编码区的基因片断和非编码区的信号序列以及5和 3长末端重复区long terminal repeat。除了 HIV 外，核酶还用于其它病毒的研究如B 型肝炎病毒的活性、C 型肝炎病毒、免疫缺陷病毒、 T 细胞白血病病毒、B 病毒等。因此，核酶在病毒基因工程中的作用将不可限量，很可能带来战胜艾滋病的福音。联合用药 drug combination therapy药物的靶向制剂的研究开发：open up and develop TargetedDrug System针对这一问题， 近年来开展了上述药

28、物的肝靶向制剂的研究。所谓靶向制剂(Targeted Drug System) ，是通过应用一定的生物、化学和物理技术，将治疗药物和靶向载体交联制备而成。 机体给药后靶向制剂能特异性地将治疗药物运送到靶器官或靶细胞，到达高效治疗的目的。经初步研究显示，抗病毒药物的肝靶向制剂具有特异性好、选择性强、能减少药物用量和给药次数，以及降低毒副作用和提高药物疗效等优点，靶向治疗有可 1.2 能成为肝炎治疗中最有效的方法之一。无唾液酸糖蛋白受体只存在于哺乳动物的肝细胞上，能专一识别并内吞半乳糖基的糖蛋白，使其进入肝细胞内，因此半乳糖基可作为肝靶向作用的导向基团galactosyed-ACV半乳糖化 无环鸟

29、苷： ACV是一种新的核苷类抗病毒药，临床用于治疗 HB，但由于肝药浓度不高，不能大量进入肝细胞内，抑制病毒增殖效果并不理想，且对肾小管有损害作用，以半乳糖基拟糖白蛋白NGA为载体，将ACV与NGA 藕联，制备成受体介导肝靶向抗病毒药，可到达提高肝药浓度，增强疗效( drug effect)， 减少side effect的目的新型疫苗的研制Live Recombinant Vaccinegenetic engineering vaccine一、基因工程疫苗基因工程重组亚单位疫苗是用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导入原核 prokaryoticcell或真核 Eukaryoti

30、c细胞， 使其在受体细胞中高效表达，分泌保护性抗原蛋白。 提取保护性抗原蛋白， 参加适宜佐剂即制成基因工程重组亚单位疫苗。本疫苗系用基因工程技术将乙型肝炎外表抗原基因片段重组到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)内，通过对细胞的培养增殖，增殖分泌乙肝外表抗原(H Ag) 于培养液中，经纯化加佐该类疫苗的优点是：(1) 疫苗中只含有产生保护性免疫应答所必需的免疫原成分，不含传染性材料，平安性好。(2) 疫苗中减少或消除了常规活疫苗或死疫苗难以防止的热原、变应原、免疫抑制原和其他有害的反响原，副作用小。(3) 稳定性好，便于保存和运输。(4) 可用于外来病原体和不能培养的病原体，扩大了用疫苗控制疫病的范围。

31、(5) 产生的免疫应答可以与感染产生的免疫应答相区别，因此更适合于疫病的控制和消灭方 案。其缺点是：(1) 价格昂贵，虽然产品生产本身的费用不一定高，但产品研究和开发的费用通常都较高。(2) 免疫原性通常比复制性完整病原体差，需要屡次免疫才能得到有效保护。目前， 人类的乙型肝炎基因工程亚单位疫苗已被广泛应用。兽用口蹄疫基因工程亚单位疫苗、预防仔猪 和犊牛下痢的大肠杆菌菌毛基因工程重组亚单位疫苗已发挥一定作用。炭疽保护性抗原(PA) 、致死因子 (LF) 和水肿因子 (EF)优点是，平安性好，副作用小，稳定性好，便于保存和运输，扩大了用疫苗控制疫病的范围。价格昂贵， (2) 免疫原性通常比复制性

32、完整病原体差，需要屡次免疫才能得到有效保护。二、重组活载体疫苗重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌( 常为疫苗弱毒株) 构建成一个载体( 或称外源基因携带者) ，把外源基因 ( 包括重组多肽、 肽链抗原位点等) 插入其中使之表达的活疫苗。 该类疫苗免疫宿主后，在体内增殖， 并将蛋白抗原的编码基因表达成相应的蛋白质，可诱导产生的免疫比拟广泛，包括体液免疫和细胞免疫，甚至黏膜免疫。如果载体中同时插入多个外源基因， 就可以到达一针防多病的目的。 简言之， 病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点。 它具有活疫苗的免疫效力高、 本钱低及灭活疫苗的平安性好等优点。 是当今与未来疫苗研制与开发的

33、主要方向之一。 国外已研制出以腺病毒为载体的乙肝疫苗、 以疱疹病毒为载体的新城疫疫苗等。 当然， 这类疫苗有时因机体对活载体的免疫反响性质，可限制再次免疫的效果。目前，主要的病毒活载体有牛痘病毒、 禽痘病毒、 金丝雀痘病毒、 人2型和 5型腺病毒、火鸡疱疹病毒、伪狂犬病病毒、水痘带状疱疹病毒、微?简言之， 病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点。它具有活疫苗的免疫效力高、本钱低及灭活疫苗的平安性好等优点。是当今与未来疫苗研制与开发的主要方向之一。国外已研制出以腺病毒为载体的乙肝疫苗、以疱疹病毒为载体的新城疫疫苗等。当然， 这类疫苗有时因机体对活载体的免疫反响性质，可限制再次免疫的效果。目

34、前，主要的病毒活载体有牛痘病毒、人 2 型和 5 型腺病毒等转基因植物疫苗Transgenic plant用转基因方法，将编码有效免疫原的基因导入可食用植物细胞的基因组中，免疫原即可在植物的可食用局部稳定的表达和积累， 人类和动物通过摄食到达免疫接种的目的。常用的植物有蕃茄、 马铃薯、香蕉等。农杆菌介导的核转化，将携带重组质粒的农杆菌感染植物细胞后，导人的外源基因通过同源重组整合到细胞染色体上，含整合外源基因染色体的植物细胞在一定条件下长成 新的植株，此植株在生长过程中表达外源基因并将这种性状传给子代；1 DNA 疫苗简介DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质

35、粒DNA(有时也可是RNA)，它可经一定途径进入动物体内，被宿主细胞摄取后转录和翻译表达出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激机体产生非特异性和特异性2 种免疫应答反响，从而起到免疫保护作用。系指将靶 抗原编码基因 置于 真核表达 调控元件的调控下，将该质粒DNA直接进行动物体内接种，并以与自然感染 类似的方式呈递抗原，诱生特异性体液和细胞免疫应答的新理论和技术。DNA疫苗具有许多优点：DNA接种载体 ( 如质粒 ) 的结构简单，提纯质粒DNA的工艺简便，因而生产本 钱较低，且适于大批量生产；DNA分子克隆比拟容易，使得DNA疫苗能根据需要随时进行更新；DNA分子很稳定，可制成 DNA疫苗冻干苗，使用时

36、在盐溶液中可恢复原有活性，因而便于运输和保存；比传统疫苗平安，虽然 DNA疫苗具有与弱毒疫苗相当的免疫原性，能激活细胞毒性T淋巴细胞而诱导细胞免疫，但由于DNA序列编码的仅是单一的一段病毒基因，根本没有毒性逆转的可能，因此不存在减毒疫苗毒力上升的危险(Davis 等， 1999) ，而且由于机体免疫系统中DNA疫苗的抗原相关表位比拟稳定，因此DNA疫苗也不象弱毒疫苗或亚单位疫苗那样，会出现表位丧失(Donnelly等， 1999) ；质粒本身可作为佐剂，因此使用DNA疫苗不用加佐剂，既降低本钱又方便使用(Babiuk 等， 1999) ；将多种质粒DNA简单混合，就可将生化特性类似的 抗原(

37、如来源于相同病原菌的不同菌株) 或1种病原体的多种不同抗原结合在一起，组成多价疫苗，从而使1种DNA疫苗能够诱导产生针对多个抗原表位的免疫保护作用，使DNA疫苗生产的灵活性大大增加。1 DNA疫苗简介DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA(有时也可是RNA)， 它可经一定途径进入动物体内，被宿主细胞摄取后转录和翻译表达出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激机体产生非特异性和特异性 2 种免疫应答反响，从而起到免疫保护作用。DNA疫苗免疫机制DNA疫苗常用于表皮，肌肉和静脉接种DNA，均可产生保护性免疫应答。皮肤接种常用于表皮或皮下接种方式。皮肤及黏膜组织大多首先

38、与外来抗原接触。在皮肤相关的淋巴组织中含有多种促进免疫应答的专一细胞。 其中角质细胞为主要表达细胞。 它可产生 IL-1,TNF-a ，可激活表皮中的 APC如树突状细胞， 巨噬细胞，朗罕细胞 ，将摄取和加工处理的抗原转运到淋巴结。 这些细胞除可直接摄取和表达质粒 DNA外，还可摄取， 表达由死细胞释放的外源 DNA。在外源基因启动子作用下，使外源基因表达，产物在细胞内水解酶的作用下分解成长短不一的多肽。其中一局部转移至内侄内质网 (ER) 腔内，与新组装的 MHC-I类分子结合形成抗原肽： MHC-I类分子复合物，逼供内提呈给 CD8+T细胞，诱发特异性细胞杀伤效应。 另一局部转移到溶酶体和

39、内体， 经加工处理降解为多肽， 与 MHC-II 类分子形成抗原肽： MHC-II 类分子复合物，将抗原提呈给 CD4+T细胞，活化的 Th1 型 CD4+T细胞分泌细胞因子，并使巨噬细胞活化，活化的巨噬细胞能吞噬胞内寄生病原生物，如结核杆菌，麻风杆菌等，也能吞噬所中胞外细菌。活化的 Th2 型 CD4+T细胞分泌 IL-4,IL-5,IL-6,IL-10, 与 B 细胞增殖，成熟，促进抗体生成有关，可增强 抗体介导的免疫应答。骨骼肌细胞是目前所知摄取外源DNA效率最高的组织。但无MHC-II 类分子，只表达较少的MHC-I类分子，缺乏共刺激分子 B7 的专职 APC，但非专职 APC也可有效

40、地将抗原提呈给T 细胞。由 T 细胞接受肌肉细胞表达的抗原肽：MHC-I类分子复合物的第一信号，同时接受炎症反响吸引的来自血液免疫细胞所带的共刺激信号而活化。提示抗原提呈与共刺激新并不是要由同一细胞提供，此外，肌肉细胞表达的抗原可通过某些途径转移到专职APC 内，由专职 APC将抗原加工处理后，提呈给CD4+T细胞,CD8+T细胞，诱导出细胞免疫和体液免疫。尽管肌细胞本身缺乏以诱导CTL, 但肌细胞通过表达多种细胞因子，当表达IFN-a,TNF-a 时可诱导 MHC-I,MHC-II 类分子 ICAM-1/CD54, LFA-1,LFA-2,LFA-3 的表达，由此可诱导产生细胞免疫和体液免疫

41、。DNA疫苗的注射途径l直接肌肉注射注射的 DNA在肌肉细胞中以环型分子存在，不能复制，并不能整合到宿主细胞染色体中。肌肉细胞中特有的横管系统与细胞外空间有直接交通， 因而可能介导质粒DNA的内吞作用。 而且横纹肌中溶酶体和DNA酶的含量较低， 可能也是质粒 DNA能在细胞中存在较长时间的原因。l微离子轰击介导的 DNA免疫即基因枪。 其技术依据是亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA，将包裹有金粉或钨粉的DNA 质粒，借助高能电场以极快的速度轰击动物表皮组织，能获得满意的免疫效果。影响 DNA疫苗免疫效果的主要因素接种方式Leitner等将编码疟原虫环子孢子抗原的质粒通过肌注途径和基因枪介导的表皮途径免疫BALB/C小鼠。研究发现，基因枪皮内接种比肌肉内直接注射的免疫效果要好。免疫效果前者比后者高600-6000 倍，且所用 DNA剂量也减少。由肌肉注射的 100-200ugDNA疫苗减至用 0.04-0.4ug纯化的 DNAS。接种途径Fynan 等发现骨骼肌注射接种免疫效果最正确。真皮，表皮，静脉注射效果较好。腹腔内注射效果较差。接种部位的预处理Davis 等对小鼠免疫前肌肉注射100ul 10mmol/L 心肌毒素，然后接种HbsDNA疫苗，结果发现产生抗Hbs抗体水平比对照组高 10 倍以上。另有实验说明，在注射部位用25%高渗蔗糖进行预处理