白菜雄性不育基因的研究毕业论文

1、 目的:获得并分析与白菜育性相关的花粉囊特异性富含脯氨酸蛋白基因BFAPG的表达。毕业论文任务书论文标题发布任务日期学生教师论文主要内容本研究以本课题组转育的大白菜雄性不育两用系AB01为材料，采用抑制消减杂交技术。二。论文的基本要求1.收集相关信息:要求尽可能收集第一手资料，要真实、可靠、有代表性。2数据的整理和分析:需要明确的顺序和详细的数据分析。3查阅相关文献:要求贴近主题，有参考价值。4认真写论文，一万多字。三。论文工作时间表阶段论文每个阶段的名称日期一个毕业论文设计 2从现场实验室获取数据。 三实验数据分析 四整理资料，写论文。 五纸张完成 备注:四。要收集的信息和主要参考资料(由讲

2、师指定)1、注:本任务由指导教师填写，一式两份，学生一份，指导教师留存一份。农业毕业论文选题审批表主题名称主题源自由的学生编号特定主题园艺教师纪职称副教授研究允许研究计划论文讲师的意见研究室的意见学术观点毕业论文指导记录学生特定主题园艺教师纪职称副教授今年指导毕业生人数四论文(设计)题目手指引线时间位置向导 主楼334蔬菜实习基地主楼327实验室主楼327实验室主楼327实验室主楼334主楼334论文的写作和研究的内容。花粉采集，实验材料的制备准备实验，收集数据。掌握实验中的所有实验环节和步骤，会使用仪器，懂方法。资料、文献和综述的整理论文的总体规划和写作论文写作指导学生签名:年日讲师签名:年

3、日教研室主任签名:年日农业毕业论文考试形式论文题目:学号:专业:园艺讲师的评论:讲师(签名):年日审查者的意见:审核人(签名):年日国防委员会意见:成就:主席(签名):年日摘要序大白菜。pekinensis Makino)是十字花科芸薹属的一个亚种，原产于中国。栽培历史悠久，资源丰富，类型多样。它是我国重要的蔬菜之一，在各种蔬菜中栽培面积最大。在国际上，大白菜也从中国传到了世界其他国家，其中日本、韩国和东南亚的栽培历史悠久。近年来，欧美国家都有不同程度的引进和发展。白菜产量高，耐储藏，营养丰富。不仅适合炒、煮、拌、腌制，还可以生吃，越来越受到人们的喜爱。大白菜是典型的异花授粉作物，品种间或自交

4、系间的一代杂种具有明显的杂种优势。国外大白菜的绝大多数优良品种都是一代杂交种。杂交一代种子的生产是杂种优势利用的关键步骤之一。自国家六五攻关以来，育种技术和方法有了很大的改进，相继育成了一大批优质、抗病、高产的杂交种，并在生产中得到推广利用。大白菜一代杂交种制种常用自交不亲和系和雄性不育系。自20世纪70年代以来，为了克服自交不亲和系的缺点，我国培育了许多大白菜隐性核不育系。大白菜隐性核不育两用系的利用，解决了利用自交不亲和系制种的亲本繁殖困难、生活力下降的问题。但在杂交生产时拔除亲本系中50%的可育株，增加了育苗成本。另外，如果不把可育株全部拔掉，杂交率会降低，种子质量也无法保证。因此，利用

5、细胞质雄性不育系制种是生产一代杂交种子最经济有效的途径之一，因此受到世界各国育种家的重视。1.植物雄性不育1.1植物雄性不育研究简史雄性不育是指植物不能产生正常的花药、花粉或雄配子，但其雌性生殖系统发育和营养生长完全正常的一种生物学现象，广泛存在于开花植物中。早在1863年，科尔罗伊特就观察到了男性不育的现象。一个世纪后，科尔曼首次提出了“植物雄性不育”的概念。目前已在43科162属320种的617个品种或种间杂种中发现雄性不育2。1.2植物雄性不育的类型和遗传机制植物雄性不育有许多不同的表现。常见的有:(1)男性器官萎缩、畸形或消失；(2)不能形成正常的小孢子发生组织；(3)小孢子发育异常，

6、导致不完善、无活性的畸形或败育花粉；(4)花粉不能成熟或萌发；(5)可形成活性花粉，但花药不开裂。植物不能产生功能性花药、花粉或雄配子的现象称为雄性不育3。植物雄性不育是核基因或细胞质基因或两者互作的结果。雄性不育的表型是不育基因表达的结果，而基因型是不育的遗传本质和遗传模式。导致男性不育的因素是多方面的，因此，由于标准不同，出现了不同的分类系统。西尔斯根据遗传机制的不同，将植物雄性不育分为细胞核雄性不育、细胞质雄性不育和核质互作雄性不育三种类型，称为“三型论”。Edwardson(1956)将“三型理论”中的细胞质雄性不育和细胞质雄性不育合为一类，从而将植物雄性不育分为细胞核雄性不育和细胞质

7、雄性不育(常简称细胞质雄性不育)简称“两型理论”。Gabelman(1956)根据花粉和雄蕊的形态将雄性不育分为花粉型、雄蕊型和功能型。Heslop-Harrison(1971)根据世代交替将雄性不育分为孢子体不育和配子体不育。在总结前人研究的基础上，Kaul将植物雄性不育分为两类:非遗传型和遗传型。随着对细胞质雄性不育基因有特异作用的核基因的发现，证实了细胞质雄性不育只是细胞质雄性不育的一个短暂过程，不能认为是雄性不育的一种类型。因此，根据不育性的基因型构成，植物雄性不育有两种类型:细胞质雄性不育和细胞核雄性不育。简称核雄性不育(GMS)或核雄性不育(NMS)，简称细胞质雄性不育(CMS)。

8、1)细胞核雄性不育核不育受核基因控制，其功能不受细胞质类型影响。因此，这类雄性不育的遗传和表达完全遵循孟德尔遗传规律。根据不育基因与相应可育基因的显性和隐性关系，可分为隐性核不育和显性核不育。隐性核不育的遗传受一对隐性基因控制。而显性核雄性不育的遗传不仅仅是由一对基因控制，通过对遗传数据的分析，至少是由两对或两对以上的基因控制。2)核质互作雄性不育这种雄性不育是由不育细胞质因子和不育核基因控制的。当细胞核中存在显性恢复基因(Fr)时，Fr基因可以抑制不育细胞质的效应，产生雄性育性。3)细胞质雄性不育这种不育性完全由细胞质遗传物质主导，与核基因无关。其遗传方式为母系遗传。当这种不育类型与细胞质可

9、育的雄性亲本交配时，其后代总是不育的。理论上，这类不育系只有保持系，没有恢复系。1.3植物雄性不育的来源1)自然突变雄性不育的自然发生是由于核基因或细胞质基因或两者的自然突变。从可育基因到不育基因的突变频率非常高。异花授粉植物在自花授粉或近亲交配时更容易产生不育突变。2)种间杂交植物雄性不育不仅发生在物种中，也发生在种间或属间杂种的后代中。约74%的核质雄性不育来自种间或属间杂种的后代。3)物理和化学诱导用物理和化学诱变剂单独或联合处理已在35个物种中诱发雄性不育。在诱导的雄性不育中，射线处理占25%左右，X射线处理占21%，EMS(乙基甲基硫醚)占20%，NUM(N-亚硝基N-甲基氨基甲酸乙

10、酯)占8%，EI(乙烯亚胺)占6%，秋水仙碱占5%，neu(硝基硒)占5%。当找不到合适的遗传雄性不育时，化学杀雄剂的开发和利用在一代杂交种的制种中起着重要的作用。4)基因转移发现的雄性不育基因可以通过连续回交和反复选择转移到其他农艺性状优良的基因型作物中。由于雄性不育类型不同，显性和隐性基因不同，育种需要不同的方法。如萝卜不育细胞质给油菜、大白菜、甘蓝等作物。5)原生质体融合在有性杂交中，细胞质基因组只来自母本，而在体细胞杂交中，杂种具有双亲的细胞质基因组。因此，体细胞杂交为研究亲本细胞器间的相互作用提供了一种新的手段，这种杂种被称为细胞质杂种(Cybrid)。原生质体融合技术不仅可以将一个

11、物种的雄性不育细胞质与另一个物种的核基因组结合，创造出新的雄性不育系，还可以对现有的不育细胞质进行遗传修饰，去除一些不良特性。原生质体融合技术应用于芸薹属作物的改良已有十余年，在细胞质基因转移、抗性基因转移和新种质创造等方面取得了一定的成果。芸薹属种、种、属、小种间的体细胞杂交实现了细胞质基因组转移，细胞质雄性不育系得到改良或创造。6)基因工程目前，基因工程创造雄性不育的策略是利用花粉发育的特异启动子与外源基因谐和，构建表达载体，转化植物阻断花粉发育过程，从而达到雄性不育的目的。(1)细胞霉素基因的表达破坏花药绒毡层，产生雄性不育。绒毡层是开花植物花粉发育过程中特有的分泌细胞，其活跃世代与花粉

12、发育密切相关。(2)它可以通过影响小孢子发育而产生雄性不育系。Spean等(1992)将Rhizogenes的rolB基因与金鱼草Tap1启动子融合，发现烟草转化后花药生长素增加，导致雄性不育4。(3)利用反义RNA技术获得植物雄性不育。花粉发育是一个复杂的过程，许多基因与花粉发育有关。利用反义RNA技术阻断花粉发育相关基因的表达，可以获得雄性不育植株。(4)早期降解获得雄性不育。在孢子母细胞减数分裂后，它作为小孢子的临时膜，将产生的四分孢子分开，防止它们彼此粘连和融合。绒毡层合成和分泌的特异性对花粉的正常发育起着决定性的作用。通常，小孢子形成外壁后，Curtis等(1996)在PSL启动子下

13、连接-1和3-葡聚糖酶，通过农杆菌介导的方法也获得了莴苣的雄性不育植株5。(5)细菌基因在植物中的组成型表达导致雄性不育。Schmulling(1988)等将根癌农杆菌T-DNA和CaMV35S启动子之间的rolC基因串联成嵌合基因转化烟草，获得雄性不育植株。(6)随着分子研究的深入，发现细胞质雄性不育与线粒体基因密切相关。现在，已经在玉米、矮牵牛和油菜的线粒体DNA中发现了CMS相关基因。通过基因工程扰乱线粒体与细胞核之间的信息交换，可导致男性不育。2.差异表达基因的分离方法差异表达基因的分离方法主要包括差异筛选、消减杂交、mRNA差异显示技术、仲裁引物PCR RNA指纹图谱、代表性差异分析

14、(RDA)、微阵列技术、抑制性消减杂交(SSH)和cDNA-AFLP(扩增片段长度多态性)，其中SSH应该是应用最广泛的方法。2.1 ssh的基本原理抑制性消减杂交技术利用二级杂交动力学原理，即退火时高丰度的单链cDNA比低丰度的单链cDNA更快产生同源杂交。在测试组(测试者)和驱动组(驱动者)的cDNA复性过程中，不同丰度的原始单链cDNA被均质化。同时，由于实验组的两半cDNA在杂交前加入了不同的接头，杂交过程中会产生五种不同类型的分子A、B、C、D、E(图1)。当与两个不同接头互补的引物用于PCR扩增时，只有靶序列被有效扩增，而非靶序列在退火时容易产生“壶柄”样结构，因此它不能与引物配对

15、，扩增受到影响2.2抑制消减杂交(SSH)技术的主要步骤步骤:(1)cDNA合成和酶切；(2)将实验组的cDNA分成两部分，用两种不同的接头连接；(3)实验组的cDNA与驱动组的过量cDNA杂交；(4)与接头连接的试验组的cDNA分子的选择性PCR扩增；(5)克隆PCR产物，构建消减文库；(6)筛选文库。2.3抑制性消减杂交(SSH)的优缺点优点:抑制性消减杂交(SSH)是一种基于抑制性PCR和消减杂交的简单有效的方法1。通过一次消减杂交，可以将低丰度序列(mRNA)富集1000倍以上，可以有效地选择性扩增靶序列，抑制非靶序列的扩增。因此，SSH在基因分离，尤其是低丰度差异表达基因的分离中具有

16、更广阔的应用前景。缺点:SSH方法一般只用于比较分析两个样本的差异。样本之间的差异不能太大也不能太小，但对于多个样本却无能为力，大大限制了它的应用。提取测试者RNA的时间非常关键。在选择这种方法时，首先要根据不同的研究目的，确定选择材料的最佳时间。选料时间不当会给实验带来意想不到的困难，也许只能得到几个消减克隆或者根本得不到克隆，或者得到一些非客观克隆。从技术角度来说，提取的测试RNA和驱动RNA的质量、酶切效率、接头连接效率、第二次PCR产物的转化效率以及消减克隆的筛选方法，都关系到测试的成败。另外，SSH需要大量的初始RNA，一般为几微克，所以一些难以获得足够RNA的珍贵稀有材料要慎用。2

17、.4.抑制消减杂交在男性不育研究中的应用。自1996年提出以来，SSH技术已经成功地应用于动物研究领域的分子遗传学和基因克隆的许多研究中，例如识别在病理变化、生物体生长发育和组织分化过程中表达发生变化的基因，以将其与其他基因区分开来。自1999年Birch等在马铃薯晚疫病研究中首次将该技术成功应用于植物领域以来，近年来该技术在植物中的应用取得了很大进展，SSH已应用于水稻、玉米、小麦、马铃薯、大豆、辣椒、胡萝卜、大麦、棉花、康乃馨、拟南芥、甘蔗、甜菜、人参、芒果和灌溉等。为了进一步研究粘性小麦雄性不育的分子遗传机制，夏虹等人利用抑制消减杂交技术构建了粘性小麦育性相关基因的cDNA文库。文库质量

18、测试表明消减杂交效率高、质量好。从不育和可育cDNA文库中随机选取120个阳性克隆进行测序，获得了100多个高质量的表达序列标签(ESTs)。经过BLAST比较和序列的功能注释，cDNA文库的基因表达谱显示，参与能量产生的基因在可育cDNA文库中频繁出现，在不育cDNA文库中检测到与花发育调控相关的MADS-box转录因子、与凋亡相关的泛素结合酶和抑制淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相关基因。发现这些基因与生育有关。郭爽等人以辣椒细胞质雄性不育系23A和121A及其相应的近等基因恢复系23C和121C为实验材料，通过抑制性消减杂交(SSH)成功构建了CMS恢复基因诱导表达的消减cDNA文库

19、。高密度点矩阵膜杂交差异筛选获得282个阳性克隆。通过测序，去除重复序列获得了175个独特的ESTs。GenBank上的BLAST分析显示，55个EST片段找不到对应的同源序列，可能代表新基因。找到了20个EST片段的同源序列，包括103个已知功能基因和17个未知功能基因。根据MIPS功能分类，可分为14个功能组，涉及世代、应激反应、蛋白活性、转录因子、信号转导等功能。辣椒CMS类型的相关线粒体基因已被鉴定(Kim等，2007)，但相关核育性恢复基因的分离和克隆很少。钟松等，2001年，利用SSH技术分离了辣椒CMS育性恢复相关的est，构建了辣椒CMS育性恢复相关的cDNA文库，为进一步研究

20、辣椒育性恢复相关基因奠定了基础。同时，实验材料中的不育系和相应的恢复系都是近等基因系，理论上保证了获得的差异表达基因只与恢复系基因位点相关。3脂肪酶的作用酶是三酰基甘油水解酶，催化天然底物。 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/baike.baidu%20%20%20%20/view/1023507.htm t _blank 油的水解，以生产脂肪酸、甘油和单酸甘油酯或二酯。脂肪酶的基本单位是 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/baike.baidu%20%20%20%20/view/15155.htm t _blank 氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性

21、只取决于它的 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/baike.baidu%20%20%20%20/view/380971.htm t _blank 蛋白质结构。脂肪酶是一种具有多种催化能力的酶，可以催化 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/baike.baidu%20%20%20%20/view/207415.htm t _blank 甘油三酸酯酯和一些其它水不溶性酯 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/baike.baidu%20%20%20%20/view/19501.htm t _blank 水解、醇解、酯化、酯交换和酯的逆合成反应。此外，

22、它还显示了其他酶的活性，例如 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/baike.baidu%20%20%20%20/view/3851489.htm t _blank 磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰基肽水解酶活性等(Hara；施密德).脂肪酶的不同活性取决于反应体系的特性，如在油水界面促进酯水解，而酶促合成和酯交换反应可以在有机相中进行。酶广泛存在于动物和植物中 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/baike.baidu%20%20%20%20/view/3736.htm t _blank 微生物英寸油料作物的种子，如蓖麻籽和油菜籽，在植物中含有更多的脂肪酶。

23、油料种子萌发时，脂肪酶可以与其他酶协同催化油脂分解产生糖类，为种子生根发芽提供必需的营养和能量。第四代脂肪酸与男性不育生物体被脂肪酶水解，在脂肪酶的催化下生成一分子甘油和三分子脂肪酸。脂肪酶的特点:主要作用于带有酯键的化合物，无论脂肪来自什么组织，无论脂肪酸碳链长短，只要是酯键，脂肪酶都能将其断裂。这就是酶的特异性，也就是键特异性。其实脂肪的水解不是一步完成的，而是一步一步来的。第一步是水解第一个或第三个全酯键，即或酯键。如果酯键在第一步中水解，而酯键在第二步中水解，则生成和脂肪酸和甘油酯。最后-位的-脂肪酸在转移酶的催化下转移到或位，然后脂肪酸在脂肪酶的作用下水解联产。脂肪(甘油三酯)的水解

24、产物:一分子甘油和三分子脂肪酸。采用高效液相色谱法和气相色谱法分别分析了红莲型细胞质雄性不育水稻同核杂种YTA和YTB的全膜、膜和外膜磷脂类型及脂肪酸组成，并采用面积归一化法定量分析了膜磷脂组分与脂肪酸的含量比值。结果表明，同核但育性不同的YTA和YTB的线粒体膜磷脂组成和脂肪酸比例存在明显差异，且二者在外膜上的差异显著大于膜上的差异。磷脂膜中含量最高的组分PE在不育系YTA和可育同核异质系YTB之间差异显著，YTB的含量显著高于YTA。总膜和膜的PI含量有显著差异，即YTA的含量高于YTB，而PA含量无显著差异。与细胞膜相比，外膜磷脂含量在YTA和YTB差异较大，尤其是PE、PA和PC的含量

25、。不育系YTA线粒体总膜磷脂含量最高的脂肪酸组分18C:0含量显著高于同核异质YTB，而YTB多不饱和脂肪酸(N:2和N:3)和IUFA含量显著高于YTA。线粒体外膜磷脂脂肪酸的组成和不饱和度与全膜相似。与全膜和外膜相反，IUFA和YTA在YTB线粒体膜中没有显著差异。这表明线粒体的膜磷脂组成和脂肪酸比例可能受细胞质基因的影响，可能与HL-CMS的育性有关。齐远(2006)烟草游离脯氨酸含量与雄性不育的关系表明，小蕾期不育系花蕾中脯氨酸含量与其保持系非常接近，但从中蕾期开始，保持系脯氨酸含量急剧上升，而不育系花蕾中脯氨酸含量基本保持稳定，因此大蕾期不育系花蕾中脯氨酸含量明显低于其保持系。不育系

26、的游离脯氨酸含量在生长中期与相应的保持系基本没有大的差异，在生长后期有一定的差异，但这些差异变化不规律。因此，花蕾中游离脯氨酸含量与烟草雄性不育密切相关，不育系花蕾中脯氨酸含量低是雄性不育的结果。叶片中游离脯氨酸的含量与烟草雄性不育没有直接关系。5.花粉囊特异性富含脯氨酸蛋白(APG)的功能花药特异的富含脯氨酸的蛋白(APG) Roberts等(1993)发现花药特异的富含脯氨酸的蛋白在阿拉伯芥菜的花药中表达。他们用APG启动子启动该基因，并将其移植到甘蓝型油菜中。结果，发现该基因在许多不同种类的花细胞中持续表达。Amr Ageez等(2005)在研究裂褶菌雄性不育相关基因的表达时，分离出AP

27、G基因，并将其命名为SIAPG，这表明SIAPG只在花药中表达，而不在雌蕊中表达。这个基因可能与花粉粒的形成有关。6.不育花粉囊特异性富含脯氨酸蛋白的研究现状。一般来说，花药中游离氨基酸的含量，尤其是游离脯氨酸的含量与花粉育性密切相关。朱光连等人分析了太谷核不育小麦可育株和不育株在显性单基因控制的不同发育阶段花药和雌蕊中游离脯氨酸和游离总氨基酸的含量。结果表明:(1)在小孢子母细胞减数分裂过程中，不同育性花药中游离脯氨酸含量差异不显著，含量较低。(2)小孢子单核早期，可育花药中游离脯氨酸含量显著高于不育花药，是不育花药的7倍，减数分裂的20倍，达到其干重的1.65%，占其游离氨基酸总量的50%

28、。(3)雌蕊中游离脯氨酸含量远低于花药，不同育性植株间无明显差异。(4)花药减数分裂过程中，不同可育株间游离氨基酸含量差异不显著。在小孢子单核初期，可育株高于不育株。雌蕊中，对应单核初期，可育株略高于不育株，受精后迅速趋于一致，但整体变化幅度不大。这种现象常见于小麦、玉米、高粱、洋葱、番茄、辣椒和水稻(张和克罗斯，1983)。王强等(2002)用化学阉割和增加脯氨酸的阉割方法影响棉花花药中的氨基酸，得出化学阉割引起的氨基酸替代失衡可能是雄性不育的主要原因之一。原因可能是植物受到胁迫后，光合作用减弱(可以用叶绿素含量降低来解释)，棉花叶片合成的Pro减少，转运到花药的Pro减少。当棉花植株受到化

29、学不育剂的胁迫时，它们表现出的生理反应是硼、锰、硫、铜、锌、镁、钙和铁等矿质营养的吸收和运输受到影响。5.研究的目的和意义。大白菜是两性异花授粉的蔬菜作物，杂种优势十分显著。由于其花器官小、每花种子少、单位面积播种量大，常规杂交制种不可避免地存在去雄、劳动强度大、成本高等缺点。利用雄性不育系是大白菜杂交种经济可靠的制种方法(日飞，2000)。获得的大白菜雄性不育材料可分为两种类型:细胞核雄性不育(GMS)和细胞质雄性不育(CMS)。由于核雄性不育材料的雄蕊退化一般比较彻底，不育性稳定，没有良性伴生物，因此备受育种家的关注。理想雄性不育系的不育株率应为100%，其经济性状具有较高的配合力。199

30、1年，我们课题组在大白菜雄性不育两用系轮换试验中首次育成不育株率达100%的雄性不育材料。由于传统的单基因隐性或显性遗传无法解释这一遗传现象，提出了“大白菜核基因雄性不育复等位基因遗传假说”(冯辉等，1995)，这一假说被后来的实验所证实(冯辉等，目前我们的研究组已经建立了一套该材料的应用技术体系，实现了品种和亚种间核不育复等位基因的互换，育成了一批不育株率达100%的新型雄性不育系，但雄性不育的分子原理尚不清楚。我们研究组通过抑制消减杂交和cDNA-AFLP方法发现了一系列与育性相关的基因，但单个基因的功能和作用位点尚不清楚。本研究对大白菜花粉囊特异性相关的富含脯氨酸蛋白基因BFAPG的功能

31、和时序表达进行了研究，为探索多等位基因遗传的大白菜核雄性不育机理奠定了基础。1材料和方法1材料和方法1.1实验材料本研究使用的材料是本课题组转育的大白菜雄性不育系A“AB01”。不育材料和可育材料除育性外背景相同，是研究差异基因分离的理想材料。两用系A的花蕾开放时，分别取不育株和可育株的花蕾进行研究。1.2实验方法取样方法开花后，取不育株和可育株的花蕾进行研究。根据可育和不育芽中花药的发育变化，我们初步将芽分为6级，即1级(芽长 3.5毫米)。选择花期和其他性状相同的不育和可育材料的未开放花蕾，按上述标准分为6个等级。此外，56级大芽选用了萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊四种材料。放入1.5mlPE管中

32、，液氮冷冻，保存于-85冰箱中。RNA提取1器具处理、溶液制备和无核糖核酸酶操作将各种规格的1.5 ml PE管、0.2 ml PCR管和枪头在0.1% DEPC溶液中浸泡过夜，121高压灭菌30分钟。用0.1% DEPC水配制75%乙醇，5molL-1 NaAc，高压灭菌。新型无水乙醇、氯仿和异丙醇。RNA提取和cDNA链合成均在无菌手术台上进行。总RNA提取和质量分析用RNA简易总RNA试剂盒(天根公司，离心柱型)提取总RNA。参考说明书，具体步骤如下:取0.5-1.0克样品，用液氮研磨，迅速加入1毫升RZ裂解液，涡旋1分钟，室温放置5分钟。加入200l氯仿，剧烈摇动15s，并在室温下放置

33、3 min。12000 rpm离心10 min，将上层水转移至约500 l的新试管中，缓慢加入0.5倍无水乙醇，混匀，转移至吸附柱CR3。在4下以12，000 rpm离心30秒，弃去废液。向吸附柱CR3中加入500l去蛋白溶液RD，在412000 rpm离心30秒，弃去废液。加入700l冲洗液RW，室温下静置2 min，在4下以12000rpm离心30秒，弃去废液。加入500l冲洗液RW，室温下静置2 min，在4下以12000rpm离心30秒，弃去废液。将吸附柱CR3放入2 ml试管中，加入50无酶ddH2O，室温下静置2 min。在4下以12000 rpm离心2分钟。重复操作10-11，并

34、将所得溶液合并两次。取3.5l RNA样品，加入1l 6上样缓冲液，然后在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，电压为6Vcm-1，电泳15-20min后，用凝胶成像仪拍照分析。1.2.3获得目标片段的方法提取的mRNA用Micro-Fast Track 2.0试剂盒(Invitrogen)提供的试剂纯化，遵循试剂盒推荐的方法。用PCR Select cDNA Subtraction Kit(Clontech)提供的试剂进行抑制性消减杂交，按照试剂盒说明，将可育株为试验组，不育株为试验组的正向和反向SSH的第二次PCR产物分别连接到载体pGEM-T-easy(Promega)上。转化大肠杆菌JM109的感

35、受态细胞，在含有IPTG和X-Gal的LB氨苄青霉素培养基上培养，在96孔板中选择白色阳性克隆，分别形成正向和反向消减cDNA文库。用通用测序引物(M13/puc反向测序引物)通过PCR选择和检测白色克隆。选择PCR呈阳性的克隆，并将其发送给配送员进行测序。测量序列后，去除载体和接头序列以获得目标片段。1 . 2 . 4逆转录聚合酶链反应以可育株和不育株的芽为材料，重复三次，每次重复为10株混合芽。分别提取RNA(方法同1.2.1)，用M-MLV (PROMEGER)合成第一链cDNA(参考说明书)。第一条链cDNA合成反应如表1所示:表1第一链cDNA合成的反应体系成分成分反应体系反应体系模

36、板rna2.0微克5倍第一链合成缓冲液4.0微升dNTP混合物1.0微升核糖核酸酶1.0微升寡核苷酸182.0微升逆转录酶(M-MLV)(200单位/微升)1.0微升无核糖核酸酶的ddH2O将体积设置为20.0微升按上述体系将各组分轻轻搅拌混合，室温放置10分钟，移至42恒温水浴中，反应1小时，反应结束后在冰中冷却2分钟。确定线性扩增周期，以不同浓度的可育cDNA为模板，检测不同循环下参考基因肌动蛋白产物量的差异，找出线性扩增周期的循环数作为半定量过程中的参考循环数。基因底漆顺序(53)产品长度/bp退火温度/肌动蛋白FATCTACGAGGGTTATGCT41254稀有ccactgaggaga

37、cgatgtttBFAPGFCATCAAGCCCGACGACCT41258稀有TGCGAATACTCCACCAAATRT-PCR检测:根据目的基因片段的序列，用PRIMER5和DNAMAN设计目的基因引物，并将引物序列提交给INVITROGEN公司合成。以不育芽和可育芽的第一链cDNA为模板，在线性扩增期进行半定量PCR。相关参数如表2所示。RT-PCR中防御相关基因的引物和退火温度表2用于防御相关基因表达实验的引物和退火温度PCR反应系统:成分成分反应体系反应体系模板cDNA5微升10倍缓冲器3微升dNTP混合物1.6微升上游引物1微升下游引物1微升2.5l-1 Taq酶0.4微升无核糖核酸

38、酶的ddH2O将体积设置为20.0微升PCR反应程序:1.2.5 PCR反应程序:配置好PCR反应所需的成分后，模板DNA在PCR仪上94预热30秒，使其充分变性，然后进入扩增循环。在每个循环中，模板在94变性30秒，在54退火30秒，在72延伸30秒，完成一个循环。如此循环27次，积累了大量扩增的DNA片段。最后，将产品在72下保温3-7min，使产品完全伸展，在4下保存。943分钟9430秒5430秒30次循环7230秒72 5min全长序列的获取利用Chiifu BAC文库的信息资源和本课题组参与的多国芸薹属基因组计划大白菜Chiifu的基因组测序结果，对全长cDNA序列进行了尝试。1.

39、2.7序列相似性搜索使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST工具和dbEST数据库，对特异表达的基因进行同源性比较和功能分析。根据查询序列(Query)和比对序列(Sbjct)的共同跨越部分的比对分数、E值和同源性相似性，推测特异表达基因可能的生物学功能。2结果和分析2.1 RNA提取根据可育和不育芽中花药的发育变化，我们初步将芽分为6个等级，即1级(芽长 3.5毫米)。选择花期和其他性状相同的不育和可育材料的未开放花蕾，按上述标准分为6个等级。用天根公司的RNA简易总RNA试剂盒提取RNA，提取的RNA质量合格。28S和18S的亮度接近2: 1，OD260/OD280在1.8-2.0

40、之间。(图1)F1 F6 S1 S6图1两用系AAB01不同等级花蕾的RNA电泳F1-F6可有6级可育芽；S1-S6不育芽有6个等级。2.3肉桂酸转移酶基因BFAPG片段的获得按照Clontech公司PCR-SelectTM cDNA消减试剂盒的说明，通过抑制性消减杂交和M13通用引物PCR验证，得到一条大小约为600bp的条带(图2)。克隆被送到一个活着的工人那里进行测序，在去除载体和接头序列后获得片段的序列(图3):图2抑制消减文库获得的BFSKS克隆的PCR检测结果图3 BF sks基因片段测序结果2.4 BFA PG差异表达片段的RT-PCR验证本研究以不育芽和可育芽(所有不同等级和大

41、小的芽等量混合)为材料，采用RT-PCR的方法研究BFAPG基因表达的差异。结果表明，标记基因在合成的不育芽和可育芽中有相似的表达，表明肌动蛋白基因作为不育基因研究的标记基因是可靠的。而目的基因BFAPG仅在可育芽中有较高水平的表达，在不育芽中几乎不表达，且条带肉眼难以识别。这个基因是生育相关基因(图4)。输出肌动蛋白412bpBFAPG 376bpBFAPG基因在可育和不育芽中的表达。f可育花芽；s不育芽2.5 BFAPG基因获得全长。利用本课题组参与的多国芸薹属植物基因组计划大白菜Chiifu的BAC文库和基因组测序结果信息资源，从BFAPG片段中获得的全长序列如图5所示，将该全长序列和上

42、述片段放入NCBI数据库blastn中进行两个或多个序列的比对。结果表明，全长序列的287-844与原始片段100%同源，证明两个序列是同一个基因。图5 BFA PG基因的全长序列阴影部分为与原始片段的同源区，红色为开放阅读框。2.6 BFAPG基因表达片段功能分析全长序列提交(NCBI)( HYPERLINK ./%20%20%20%20:/%20%20%20%20ncbi.nlm.n . ncbi.nlm.nI/)数据库用TBLASTX和BLASTN搜索序列相似性，以E-0.4为阈值，同源性在70%以上的见表3。用拟南芥胞外脂肪酶EXL6( HYPERLINK ./%20%20%

43、20%20:/%20%20%20%20/nucleotide/145337603%3Freport=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=WS2W4YCN011 NM_106243.3)、EXL5( HYPERLINK ./%20%20%20%20:/%20%20%20%20/nucleotide/186495667%3Freport=genbank&log$=nucltop&blast_rank=5&RID=WS2W4YCN011 NM_001084361.2)、EXL4( HYPERLIN

44、K ./%20%20%20%20:/%20%20%20%20/nucleotide/145337601%3Freport=genbank&log$=nucltop&blast_rank=13&RID=WS2W4YCN011 NM_106241.3)、EXL3(AY028611.1)和EXL2( HYPERLINK ./%20%20%20%20:/%20%20%20%20/nucleotide/145327706%3Freport=genbank&log$=nucltop&blast_rank=100&RID=WS2W4YCN011

45、 NM_001084360.1)mRNA的同源性分别为95%、96%、91%、67%和68%。几种芸薹属作物的花粉特有的富含脯氨酸的蛋白质为66%:【与大白菜( HYPERLINK ./%20%20%20%20:/%20%20%20%20/nucleotide/126567180%3Freport=genbank&log$=nucltop&blast_rank=75&RID=WS2W4YCN011 EF101148.1)、芥菜(AF458407.1)、白菜(EF101139.1)和毛果肉桂酰辅酶a莽草酸/N-肉桂酰转移酶蛋白HCQL5 mRNA( HYPERLI

46、NK ./%20%20%20%20:/%20%20%20%20/nucleotide/224143974%3Freport=genbank&log$=nucltop&blast_rank=12&RID=WS0UR9TR01N XM_002325107.1)有79%的同源性；和玉米花药特有富含脯氨酸的蛋白质( HYPERLINK ./%20%20%20%20:/%20%20%20%20/nucleotide/226491387%3Freport=genbank&log$=nucltop&blast_rank=52&RID=WS2W4

47、YCN011 NM_001157432.1)有72%的同源性。表3 BFAPG基因全长序列TBLASTX比对结果增加描述 HYPERLINK ./%20%20%20%20://Blast.cgi%3FCMD=Get&ALIGNMENTS=100&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&DATABASE_SORT=0&DESCRIPTIONS=100&FIRST_QUERY_NUM=0&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_PAGE_TARGET=&FORMAT_TYPE=HTML&GET_SEQUENCE=yes&I_

48、THRESH=&MASK_CHAR=2&MASK_COLOR=1&NEW_VIEW=yes&NUM_OVERVIEW=100&OLD_BLAST=false&PAGE=Translations&QUERY_INDEX=0&QUERY_NUMBER=0&RESULTS_PAGE_TARGET=&RID=WS2W4YCN011&SHOW_LINKOUT=yes&SHOW_OVERVIEW=yes&STEP_NUMBER=&WORD_SIZE=3&DISPLAY_SORT=4&HSP_SORT=0 l sort_mark 查询覆盖率 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/blast.n

49、/Blast.cgi%3FCMD=Get&ALIGNMENTS=100&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&DATABASE_SORT=0&DESCRIPTIONS=100&FIRST_QUERY_NUM=0&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_PAGE_TARGET=&FORMAT_TYPE=HTML&GET_SEQUENCE=yes&I_THRESH=&MASK_CHAR=2&MASK_COLOR=1&NEW_VIEW=yes&NUM_OVERVIEW=100&OLD_BLAST=false&PAGE=Translatio

50、ns&QUERY_INDEX=0&QUERY_NUMBER=0&RESULTS_PAGE_TARGET=&RID=WS2W4YCN011&SHOW_LINKOUT=yes&SHOW_OVERVIEW=yes&STEP_NUMBER=&WORD_SIZE=3&DISPLAY_SORT=0&HSP_SORT=0 l sort_mark e值普通链接 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/%20%20%20%20/nucleotide/145337603%3Freport=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=WS2

51、W4YCN011 NM_106243.3拟南芥EXL6酰基转移酶/羧酸酯酶/脂肪酶(EXL6) mRNA，完整cds95%7.00E-168一个 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/%20%20%20%20/nucleotide/186495667%3Freport=genbank&log$=nucltop&blast_rank=5&RID=WS2W4YCN011 NM_001084361.2拟南芥家族II胞外脂肪酶5 (EXL5) (AT1G75920) mRNA，完整cds96%1.00E-131一个 HYPERLINK ./%20%20%2

52、0%20:/%20%20%20%20/nucleotide/145337601%3Freport=genbank&log$=nucltop&blast_rank=13&RID=WS2W4YCN011 NM_106241.3拟南芥EXL4酰基转移酶/羧酸酯酶/脂肪酶(EXL4) mRNA，完整cds91%3.00E-109一个AY028611.1拟南芥家族II脂肪酶EXL3 (EXL3) mRNA，完整cds67%5.00E-46一个 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/%20%20%20%20/nucleotide

53、/145327706%3Freport=genbank&log$=nucltop&blast_rank=100&RID=WS2W4YCN011 NM_001084360.1拟南芥家族II胞外脂肪酶2 (EXL2) (AT1G75890) mRNA，完整cds68%7.00E-46一个 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/%20%20%20%20/nucleotide/126567180%3Freport=genbank&log$=nucltop&blast_rank=75&RID=WS2W4YCN011 EF101148.1芜菁亚种。北京栽培品种

54、黄芽14花药特异性富含脯氨酸蛋白mRNA，完整cds66%1.00E-46一个AF458407.1甘蓝花药特异性富含脯氨酸蛋白(APG1) mRNA，完整cds66%5.00E-46一个EF101145.1芥菜型油菜品种通农4号花药特异性富含脯氨酸蛋白mRNA，完整cds66%7.00E-46一个EF101139.1甘蓝型油菜花药特异性富含脯氨酸蛋白mRNA，完全cds66%7.00E-46一个 HYPERLINK ./%20%20%20%20:/%20%20%20%20/nucleotide/226491387%3Freport=genbank&log$=nu

55、cltop&blast_rank=52&RID=WS2W4YCN011 NM_001157432.1玉米花药特异性富含脯氨酸蛋白APG (LOC100284537)，mRNA gb|EU968767.172%9.00年至49年一个大白菜不同部位2.7 BFAPG基因表达分析以不育和可育植株的须根、根、茎、叶和花芽为研究材料，通过RT-PCR研究BFAPG基因的表达差异。结果表明，肌动蛋白基因在所有不育和可育植株的须根、根、茎、叶和芽中均有相似的表达，表明肌动蛋白基因作为不育基因研究的标记基因是可靠的。而目的基因BFAPG只在可育芽中高水平表达，在可育植株的其他部位和不育芽中不表达，肉眼看不到条

56、带(图6)，说明该基因是可育芽的特异表达基因。米1 2 3 4 5 6 7 8 9 10500个基点250bpBFAPG500个基点250bp肌动蛋白肌动蛋白ACTIN BFAPG和肌动蛋白基因在不育和可育植株不同部位的表达。m，DL2000记号笔；1、3、5、7和9分别是可育植物的须根、根、茎、叶和芽；2、4、6、8、9和10分别是不育植物的须根、根、茎、叶和芽。2.8 BFAPG基因在不同芽中的时序表达以不育和可育植株的不同花蕾为材料，通过RT-PCR检测BFAPG基因的表达。结果表明，肌动蛋白基因在不育和可育植株的各级芽中都有表达，而目的基因BFAPG只在各级可育芽中有表达，其表达水平基

57、本相同，但在不育芽中不表达，肉眼看不到条带(图7)，说明该基因一进入蕾期就开始发挥作用。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12500个基点250bpBFAPG肌动蛋白500个基点250bpbfapg和ACTIN基因在不育和可育植株不同芽中的表达。马克笔；1-6为可育株的1-6级芽；7-12为不育株的1-6级芽。2.9 BFAPG基因在花器官中的表达分析以可育植株的花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊为材料，采用RT-PCR方法研究BFAPG基因表达的差异，重复3次。结果表明，肌动蛋白基因在所有不育和可育植株的花芽中有相似的表达，而目的基因BFAPG只在雄蕊中表达，在花器官的其他部位不表达(

58、图10)，表明该基因是一个雄蕊特异性表达基因。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12500个基点250bp500个基点250bpBFAPG肌动蛋白BFAPG和肌动蛋白基因在花器官不同部位的表达。m:马克笔；1-3: 3重复的花萼；4-6: 3花瓣重复；7-9: 3雄蕊的重复；10-12: 3雌蕊重复3.1讨论3.1.1RNA提取保证RNA产量和纯度的措施对于cDNA文库的构建，模板RNA的质量直接影响cDNA合成的效率。分离纯化RNA的关键是消除RNA酶对RNA的降解，提高RNA的产量和纯度。总RNA浓度应达到0.5ng/ l以上为好，否则合成的dscDNA产量低，达不到建库

59、要求。质量好的RNA应该有明显的285和185，A260/A28的条带。该比值优选在1.8和2.0之间。为了获得理想的RNA产量和纯度，除了防止RNA酶污染外，还应注意以下几点:(1)取出的样品应立即处理或冷冻；(2)样品在液氮中完全裂解；(3)运行时保持低温；(4)在苯酚/氯仿萃取过程中，水相和有机相之间的变性蛋白被完全去除；(5)用足量的75%乙醇洗涤RNA(6)风干时，不要让RNA颗粒完全干燥，否则会大大降低其溶解性；(7)用吸管尖在去除RNA酶的水中吹，在55-60下孵育样品10分钟，使RNA颗粒完全溶解；(8) RNA样品保存在70的75%乙醇中。RNA通常用分光光度计定量，测量26

60、0nm处的吸收值(A260)。一般来说，分光光度计A260的读数应该在0.15和1.0之间才可靠。所以RNA提取后要根据大概的产量稀释到合适的浓度，然后用分光光度计进行测定。A260为1相当于RNA的浓度为40g/ml。本部分实验采用天根公司的离心柱RNA提取试剂盒进行RNA提取，具有步骤少、省时、产量高、提取的RNA质量好等优点。显示28S和18S的亮度接近2: 1，OD260/OD280在1.8到2.0之间(如图1)。3 . 1 . 2 BFA PG基因的功能预测根据全长序列提交(NCBI)数据库BLAST的序列相似性搜索，发现该基因与拟南芥胞外脂肪酶有95%的同源性，与几种芸薹属作物花粉