铁皮石斛 组织培养 栽培 试验 实验

1、铁皮石斛茎段组织培养与栽培-I摘要：为试验铁皮石斛茎段组织培养与栽培，以铁皮石斛茎段为外 植体，结合铁皮石斛的生物学特性，综述铁皮石斛组织培养与栽培的 过程技术。观察研究基本培养基、天然附加物和植物生长调节剂对铁 皮石斛生长的影响。验证和探究铁皮石斛茎段组织培养技术并对铁皮 石斛的组织培养与栽培管理技术进行了思考与展望。关键词：铁皮石斛；组织培养；茎段；移栽；驯化0.引言铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科 (Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)多年生草本植物，又名黑节草， 俗称铁皮枫斗，分布于云南、安徽、贵州、浙

2、江、江西、广东和广西 等地，是我国传统名贵珍稀中药材，其有效成分主要为石斛多糖、石 斛碱、氨基酸等，其中石斛多糖的含量高达21.7%，能显著提高机体 免疫功能，具有养胃出津、补肾益力、滋阴清热、耐缺氧、抗疲劳、 抗肿瘤等功效。现代药理学研究发现，石斛还具有抗衰老和扩张血管 的作用。铁皮石斛喜荫凉、湿润的环境，常附在高海拔悬崖峭壁或林内树 干和岩石缝隙中。由于其药用价值高、生长条件特殊和分布受局限， 且经长期人为采挖，野生资源濒临灭绝。铁皮石斛是2005版中华 人民共和国药典收载的3种石斛属植物之一，为石斛之极品，它因 表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛蒴果成熟时易开裂，且种子粒径小， 自然繁殖率低，

3、是一种珍稀的药用植物和和名贵的室内观赏植物.。铁皮石斛自然繁殖力极低，常规繁殖又较困难，且多年来对铁皮石斛的采集量远大于其生长量，野生铁皮石斛自然繁殖已濒临绝迹。由于 药用价值高，人为的过度开采与生态破坏，野生铁皮石斛已濒临灭绝， 1987年国务院将其列为国家重点保护植物。1材料与方法1试验材料野生云南铁皮石斛，取材于浙江农林大学组培实验室，取其茎段 作为外植体进行组织培养。1. 2试验方法1. 2. 1外植体消毒取铁皮石斛的茎，去除多余叶片后用解剖刀将茎切成含34 个节点的茎段，保留节点。依次用中性洗涤剂清洗，自来水冲洗 20min，用70%的乙醇浸泡1060 s，再转入0.1%的氯化汞中，

4、 灭菌511 min后倒去氯化汞溶液，用无菌水反复漂洗材料3-5 次。用无菌纸吸去茎段上多余水分，将其切成12 cm带一个芽点 的茎段，接种到培养瓶中培养。1. 2. 2培养基制备铁皮石斛培养基均添加3%蔗糖，0. 7%琼脂，pH值为5. 8。 按不同目的在基本培养基中加入6-BA、NAA、IBA，每个培养瓶分 装50 m培养基，密封。经过121 C高温灭菌25 min。不定芽的诱 导培养基是在基本培养基MS中加入细胞分裂素和生长素，采用不 用浓度水平的NAA和6-BA。组培苗的壮苗与生根，将生长状态稳定的试管苗接种于添加不同激素组合的1/2 MS培养基上。(1)诱导培养基：MS+6-BA0.

5、5mg / I。+NAA 0.05mg / L+AC(活性炭)29 / L；MS+6-BAl. 0mg / L+NAA0. 1mg / L+AC29 / L。增殖培养基：花宝 3 号 39 / L+6 一 BA2. 5mg / L+NAA0. 25mg /I。+AC29/L。生根培养基:1 / 2 MS+IBA0. 5mg / L+AC29 / 1。培养基中添加蔗 糖 209/L, pH5. 25. 41. 2. 3培养条件接种铁皮石斛培养材料的组培苗在组织培养室中培养，培养温度 为(26 土 2) C,光照 14 h/d,光强 1 500 2 000 lx。1. 2. 4诱导培养用解剖刀将铁

6、皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基中进 行培养。1520天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组 织形成疏松组织。继续培养20天后，转入培养基中，切面及顶部 膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒 物长大形成直径12mm的类原球茎颗粒物。1. 2. 5增殖培养将诱导形成的原球茎转入到增殖培养基中，原球茎增殖速度很 快，增殖倍数可达34倍，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出 12片小叶，原球茎的增殖与芽分化同时进行。1. 2. 6生根培养取诱导形成的不定芽，要求芽高2 3 cm,带3 5片叶的不 定芽，将其接种到不同处理的生根培养基上，进行培养。培养30天 左右，基

7、部开始出现23条约1cm长的白色根，随后逐渐伸长，生 根率达到90%以上。移栽与驯化2.1移栽前的准备2.1.1炼苗当苗高3cm以上、具34片叶时，便可炼苗。移栽前先将瓶苗 至炼苗房进行23周的炼苗，让瓶苗从封闭稳定的环境向开放变化的 环境过渡，慢慢适应自然环境，等瓶苗生长健壮、叶色正常，根长 3cm以上，肉质茎有34个节间、长有45片叶，叶色正常，根长 3cm以上，有45条根，根皮色白中带绿，无黑色根，无畸形，无变 异。炼苗目的：炼苗的主要目的是使组培苗适应外界的环境一一温差，湿度差以 及微生物环境。炼苗方法：1）将待炼苗的材料放置于欲移栽的环境，不开盖保持4-5天；2）半开盖保持1-2天后

8、，全开盖再炼苗2-3天2.1.2出瓶组培苗出瓶时，打开瓶塞将培养基与小苗一起轻轻取出，整齐放 置于盆中待清洗，污染苗、裸根苗或少根苗分别放置。正常组培苗先 在自来水中洗净培养基，特别要洗掉琼脂，以免琼脂发霉引起烂根， 再换自来水清洗一次。裸根或少根组培苗经过上述清洗后，还需将小 苗根部置于100mg/L的ABT生根粉中浸泡15分钟，以进行生根诱 导。污染苗经过清洗后，用1000倍多菌灵浸泡整株小苗10分钟。后 期管理得当可有效控制污染的发生。栽种于已灭菌的基质中（移栽前 浇透水），放置在遮光度50%60%、湿度达80%以上的温室中，2 个月后，成活率达90%以上。2.1.3基质的准备移栽铁皮石

9、斛组培苗要选择适宜的基质。铁皮石斛的根是气生 根，有明显的好气性和浅根性，因此，要求基质以疏松透气、排水良 好、不易发霉、无病菌和害虫潜藏者为宜。可以选择水苔、石灰石、 碎砖、树皮、刨花、蕨根、板边、菌糠、木糠等为移栽基质。铁皮石斛不宜深植，种植时根系向四周均匀展开，将基质填充根部、 基部必须露出，否则易造成烂根。移栽后隔5天再浇水效果较好。30 天内每隔1天喷雾1次，水量不宜过多，期间勿施肥，待小苗恢复正 常生长后才开始常规的水肥管理。2.1.4栽培场地的选择铁皮石斛喜温暖、多雾、微风、清洁、散射光环境，忌阳光直射 和曝晒。在移栽过程中要创造条件，为铁皮石斛创造最佳的生长环境。 铁皮石斛原产

10、区大多处于温带和亚热带，全年气候温暖、湿润，冬季 气温在0C以上。根据铁皮石斛的生长习性，要考虑场地的光照、温 度、湿度、通风等自然因素。笔者认为最好选择在大棚内移栽，而且 要移栽在高架畦，这样容易满足铁皮石斛生长的最佳环境要求，而且 很多自然因素容易控制。在建造育苗大棚时要满足以下三个条件：（1）育苗大棚要通电、通水、通路，要求棚宽6m、长30m、棚 肩高107m以上、棚顶高2.8m以上，棚顶覆盖塑料无滴薄膜和70% 遮荫度的遮荫网，棚内安装有自来水管，大棚四周和入口装有40目 的防虫网。有条件的，棚内还要装有自动或手动控制的喷雾系统（最 好既能喷雾，又能喷肥、喷药），这样可以防晒、防雨、防

11、虫、保温、 保湿、透气，还能大大减少劳动量。（2）棚内搭建畦底架空的高架种植畦。可用角钢、砖头、木条 或方条等材料作为种植畦的框架，然后铺设孔径为0.30.5cm的塑料 平板作为栽培基质的支撑面，要求畦宽11.2m，畦长度可自定，畦 底架空高度3050cm。种植畦上方装有可随时喷雾的喷头，喷雾饿时 间最好能控制。没有条件的，也可以用喷雾器来代替。搭建高架种植 畦的目的是为了使水分和透气容易控制，从而为组培苗生长提供最佳 水分，保证通风透气，又能同时喷肥喷药，移栽成活率高，大面积移 栽时能大大节省劳动力。（3）在种植畦上铺58cm厚的基质，摊平。移栽前用0.3%高锰 酸钾或1000倍多菌灵药液对

12、基质喷洒消毒。2.2移栽2.2.1移栽时间移栽最佳季节应为日平均气温在1530C时，气温过低或过高均 不宜出瓶移栽。一般来说，在铁皮石斛主产地，除了最冷的1-2月以 及最热的7-8月外均可栽培。部分高海拔地区，除了 12月至次年3 月，其余时间均可栽培。2.2.2移栽方法用镊子将组培苗小心取出，洗去培养基后，即可移植到种植畦上。 移栽时用手指在基质挖23cm深的小洞，轻轻把石斛根部放入小洞， 注意不要弄断石斛的肉质根，然后用基质盖好。裸根苗或少根苗最好 分开种，以便于管理。移栽密度为500 株/m2，株行距为4cmX5cm。 2.3移栽后的管理2.3.1温度管理人工移栽铁皮石斛组培苗要满足其冬

13、暖夏凉的要求。组培苗生长 适宜温度为2030C。夏季温度高时，大棚内须通风散热，并常喷雾 来降温保湿，每天喷雾35次，每次喷雾25分钟；冬季气温低时， 大棚四周要密封好，以防冻伤组培苗。2.3.2湿度管理刚移栽的组培苗对水分很敏感，缺水则生长缓慢、干枯、成活率 低。而喷雾过多则渍水烂根，温度高、湿度大时还易引发软腐病大规 模发生。移栽后一周内（幼苗尚未发新根）空气湿度宜保持在90% 左右，一周后，植株开始发新根，空气湿度可保持在70%80%。种 植畦干湿交潜有利于发根长芽。2.3.3肥水管理大棚移栽期间的施肥以叶面肥为主。由于石斛为气生根，因此要 喷施适宜的叶面肥作为营养液，以供给植株充足的养

14、分，利早发根长 芽。叶面肥可以选择硝酸钾、磷酸二氢钾、腐植酸类等，以及进口三 元复合肥和稀释的MS培养基等。一般移栽后一周，植株新根发生后 开始喷施千分之一的硝酸钾或磷酸二氢钾，710天喷一次，连续喷3 次。长出新芽后每隔10-15天喷3%。的三元复合肥等。一般情况下， 施肥后两天停止浇水。若空气对流太大，则视基质干湿度适当喷雾补 水。病虫害防治铁皮石斛的主要病害有软腐病、黑斑病、炭疽病等。软腐病发 病快，严重时整株腐烂解体呈湿腐状；黑斑病危害叶片，使叶片枯萎； 石斛炭疽病危害叶片及肉质茎，受害叶片出现黑色或褐色病斑。针对 这些常见病害要加强棚内管理、注意通风透光、适当降低棚内湿度， 及时施药

15、并拔出病株带离。铁皮石斛的主要虫害有蜗牛、菲盾蚧、红 蜘蛛等。其中，蜗牛是常见害虫，危害幼茎、嫩叶、花蕾和幼果。可 用诱杀、人工捕杀或撒石灰、茶麸防治；石斛菲盾蚧寄生于植株叶片 边缘或背面吸食汁液，可将集中有菲盾蚧的老枝烧毁或用40%乐果 乳油1 000倍等喷雾杀灭；红蜘蛛可通过除周边环境的杂草或喷低 毒杀螨剂8001 000倍防治。铁皮石斛为珍贵药材，因此铁皮石斛 的病虫害防治应尽可能以预防、物理防治和生物防治为主，不用或采 用低毒农药；一旦发现有病虫害应及时采取相应措施，避免病虫害情 的加重。思考与展望有效地控制污染是植物离体培养成功的关键。外植体造成的污染最复杂，也最难控制，其原因可能是

16、细菌引起的，也可能是真菌引起 的。微生物可能是腐生的，也可能是内生的，最难处理的则是内生菌。 铁皮石斛外植体含有较多的内生真菌，从铁皮石斛根中分离出内生真 菌约25种，因此铁皮石斛的外植体消毒应特别注意也较为困难。不 定芽诱导和增殖的基本培养基以MS为宜，同时，植物生长调节物质 对铁皮石斛的组织培养起重要作用，虽然用量小，但在植物组织培养 中使用的激素包括生长素、细胞分裂素等，而NAA和6-BA组合常 用于诱导不定芽和生根。结果与其他研究报道的铁皮石斛不定芽诱导 培养基配方有所不同，可能与培养的石斛品种有关。同时，适宜的接 种密度和不同的外植体部位都会对不定芽的诱导和增殖产生一定的 影响。试验

17、结果表明，低浓度的NAA、IBA对组培苗根系生长具有 显著的促进作用，而高浓度的NAA、IBA均对组培苗根系生长有明 显的抑制作用。适合铁皮石斛组培苗生根培养基为：1/2 MS + 0.5mg/LNAA，其次为 1/2 MS + 0. 5 mg/L IBA。目前，铁皮石斛组织培养的研究大多集中在快速繁殖、扩大繁殖 系数等方面，今后应加强铁皮石斛的基础性研究，如共生菌、光照、 温度、湿度、栽培基质等对石斛生长发育的影响，从而深入掌握石斛 生长发育的营养需求，物质合成与分解等新陈代谢规律，确定铁皮石 斛类群生长的最佳生态环境，将研究方向和成果与大田栽培紧密结合 起来，才能从根本上解决铁皮石斛培养困难，人工种植困难，产量低 等问题。参考文献：张治国，刘外，王黎.铁皮石斛原球茎增殖的培养条件研究J.中 草药 23( 8) : 431.张治国，刘外，王黎，张玲.铁皮石斛原球茎适合培养基研究J.中国中药杂志1993,18 (1) :16.蒋林,丁平,郑迎冬.添加剂对铁皮石斛组