鸡卵类粘蛋白的提取及活性和分子量测定

1、鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定一、实验目的：通过本实验的学习，掌握蛋白质的提取、分离、纯化及性质测定技术，掌握高速冷冻离心机、 可见分光光度计、核酸蛋白检测仪、电泳仪等仪器的使用。了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理。掌握电泳实验操作规程及用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定蛋白质分子量。二、基本原理：鸡卵类粘蛋白（chicken ovomucoid简称CHOM）是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，它具有 强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂， 通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。鸡卵类粘蛋白至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常呈不

2、均一性。目前至少 已获得四种不同的组分，它们在抑制胰蛋白酶的性能上和氨基酸组成上没有多大区别，但是 在糖蛋白的糖部分（主要为D-甘露糖、D-半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸）的含量上则有差别。 它们的等电点有一定的范围，大致在pH3.94.5o相对分子量28, 000。卵类粘蛋白抑制胰 蛋白酶克分子比为1： 1，因此高纯度的卵类粘蛋白1微克能抑制相当于0.86微克的胰蛋白 酶（比活力为12, 000BAEE单位/毫克蛋白）。不同来源的卵类蛋白末端基有很大差异，鸡卵 类粘蛋白N一末端基为丙氨酸（C一末端为苯丙氨酸）。CHOM在中性和偏酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，在50%丙酮或10%三氯 乙

3、酸溶液中仍有较好的溶解度，但在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。 由于CHOM在PH7.88.0的碱性条件下具有很强的结合胰蛋白酶的活性而且这种结合是可逆 的，可以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。2.1鸡卵类粘蛋白粗提取原理卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比 较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。本实验主要的方法是先将鸡蛋清经三氯乙酸（TCA） 一丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗品,在经过DEAE纤维素（二乙基 氨基乙基纤维素）柱层析纯化而得合格产品。2.2凝胶层析对鸡卵类黏蛋白

4、提取液的纯化原理蛋白质混合溶液在经过凝胶层析柱时，大分子蛋白质沿颗粒间的空隙以较快的速度流过 凝胶柱，最先流出柱外。而盐或其他小分子物质因进入凝胶颗粒的微孔中向下移动的速度较 慢，所以最后流出柱外。因此通过凝胶层析可以达到除去小分子物质的目的。2.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速、而 且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS与蛋白质的疏水部分相 结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中oSDS蛋白质复合物的 长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中

5、加入离子去污剂和强还原剂 后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。 SDS因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。三、试剂与器材3.1粗提所需试剂：丙酮，0.5M三氯乙酸，0.2M pH6.5磷酸盐缓冲液；3.2纯化所需试剂：100mL Sephadex G-25凝胶；DEAE-纤维素32或52, 0.5M氯化钠-0.5M氢氧化钠溶液，0.5M 盐酸，0.02M，pH6.5磷酸盐缓冲液,0.30M氯化钠-0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液，1.0 M氯化 钠-0.02M pH6.5磷酸盐缓冲液，聚乙二醇8000，蔗糖。3.3胰蛋白酶

6、活力及粘蛋白抑制活力测定试剂：0.05M pH8.0Tris-HCl 缓冲液，BAEE-0.05虬 pH8.0 Tris-HCl 缓冲液（每毫升 Tris-HCl 缓冲液含0.34毫克BAEE和2.22毫克氯化钙），结晶胰蛋白酶溶液（0.4mg/mL, 0.1M pH8.0磷 酸盐缓冲液配制），3.3S-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量所需试剂1）.胶母液：30%Acr-0.8%Bis贮液，Acr 150 g,Bis 4 g，重蒸水溶解，定容至500 mL。棕色 瓶中4C保存，可放置1个月左右。2）.10%过硫酸铵（AP）： 1 g APS溶于10 mL蒸馏水，4C贮存，可用一周。3）.pH

7、8.9Tris-HCI 缓冲液：Tris 92 g,1 mol/L HCI 120 mL,TEMED 2.5 ml,10% SDS 3ml 加蒸 馏水溶解，定容到500 mL。4）.pH6.7Tris-HCI缓冲液：30 g Tris，1 mol/L HCl 240 mL, TEMED 2.5ml,10% SDS 3ml加蒸 馏水溶解，定容到500 mL。5）.pH 8.3 Tris-Gly 电极缓冲液：6.0 g Tris，28.8 g Gly，1 g SDS,加蒸馏水溶解，定容至U 1000 mL。6）.样品液：pH 6.7缓冲液25 mL，甘油10 mL ,10% SDS 10 mL，巯

8、基乙醇1 mL，加漠酚 蓝少许，定容到50 mL。8）. 0.05%考马斯亮蓝R250染色液：2.5 g考马斯亮蓝，甲醇250 ml，冰乙酸50 ml，水定 容至500 mL。9）.脱色液：7%乙酸溶液。（70 ml冰乙酸，无离子水定容至1000 ml。3.4器材新鲜鸡蛋、透析袋、层析柱（1.0*20cm）、贮液瓶（柱层洗洗脱用）、试管及试管架、广泛试 纸、擦镜纸、滤纸（7cm）、移液管（0.5mL，1mL）、冰箱、计时器、恒温水浴锅、紫外分 光光度计、可见分光光度计、部分收集器、紫外检测仪（包括记录装置）高速冷冻离心机、 电磁炉、磁力搅拌器。垂直板电泳槽、凝胶模（135X100X 1.0mm

9、）样品梳、直流稳压电源， 以上产品皆为北京六一仪器厂生产。吸量管（1，5，10mL）;烧杯（25，50，100mL）；细 长头滴管；1mL注射器及6号长针头；微量进样器（10，50ML）；真空干燥器；培养皿（直 径 120mm）；玻璃板（13X13cm）；玻璃纸（18X18c）四、操作步骤：（一）粗品的制备：（1）由1枚新鲜鸡蛋大约获得25-30mL蛋清，盛于250mL烧杯内，放置于温水浴锅内使温 度达到25-30C，在不断搅拌下，缓慢加入等体积4C预冷的三氯乙酸一丙酮溶液（0.5MTCA 与丙酮的体积比为1： 2V/V），立即出现大量白色沉淀，加完后最终pH应为3.5，如高于pH 3.5,用

10、0.5M TCA调到pH 3.5,再继续搅拌30 min，然后在4C下放置1-2 h,离心（4000 rpm,20 min)，约得25-30毫升黄绿色清液。边搅拌边加入2倍于上清液体积的4C预冷的丙酮，可见白色沉淀产生，在冰箱中放 置 1-2 h。离心(4000 rpm,20 min)，弃上清液，得沉淀，加入2ml无离子水，溶解沉淀，装入透 析袋对水透析以除去残留的TCA，透析过程中有少量沉淀出现，将透析袋中的溶液离心(4000 rpm,20 min)，弃沉淀，将上清液倒入25mL量筒中，加入1/10上清液体积的0.2 M pH6.5 磷酸盐缓冲液，摇匀，测量并记录粗品总体积，可供下步上柱纯化

11、之用。粗品总体积(mL)粗品在A280处吸光度值蛋白质浓度/ (mg/mL)粗品总体积:纯化：2.1凝胶层析对鸡卵类黏蛋白提取液的纯化1)凝胶的处理：量取100mL Sephadex G-25凝胶，加入200mL磷酸盐缓冲液，沸水浴中1h。 上柱前用真空干燥器抽气。2)装柱：将柱子垂直地安装好，关闭层析柱出水口，将脱气后的凝胶缓缓地倒进柱内，使 之自然沉降。平衡：打开核酸蛋白检测仪、记录仪电源，将柱出水口与核酸蛋白检测仪比色池进液口 相连，开启柱口下夹子，用约2倍体积的pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。直至流出液在蛋白检测 仪上绘出稳定的基线。上样：取样品溶解液上Sephadex G-25层析柱。控

12、制流速15d/ min，收集蛋白峰。即可得 到鸡卵类黏蛋白粗提液。并准备进一步用DEAE-纤维素柱层析纯化。2.2DEAE-纤维素的处理及再生：新纤维素的处理：取50克DEAE-纤维素-32或DE-52 (Whatmah进口分装)，用少量 水溶胀1 h，用0.5M氯化钠溶液一0.5M氢氧化钠溶液(即1M氯化钠溶液与1M氢氧化钠溶 液等体积混合，搅拌处理20分钟、用大量的蒸馏水洗至中性。再用0.5M盐酸与0.5M氯化钠溶液搅拌处理20分钟、用大量的蒸馏水洗至中性。再用0.5M氯化钠溶液一0.5M氢氧化钠溶液处理一次，最后用大量的蒸馏水洗至中性， 放置冰箱中保存。旧纤维素的再生：省去酸处理一步，只

13、用0.5M氯化钠溶液一0.5M氢氧化钠溶液处理一 次，用大量的蒸馏水洗至中性，放置冰箱中保存。2.3装柱：层析柱垂直安装在铁架台上，夹紧柱下端的硅胶管。先加入1/3-1/2柱体积0.02 M pH 6.5磷酸盐缓冲液，取一合适大小的玻璃漏斗，安装在柱的上端(使漏斗颈的外径与层析柱 的内径吻合，不能使层析柱中的水或缓冲液渗出)。将处理好的DEAE-纤维素连同一些0.02 M pH 6.5磷酸盐缓冲液倒入漏斗，不断搅拌，使之自然沉降到1cm左右的高度，打开柱下端 的硅胶管，继续搅拌、沉降至3/4柱高。将柱下短的硅胶管连接在核酸蛋白监测仪样品池的入口。打开核酸蛋白监测仪电源，预热至少30min。2.

14、4平衡：打开蠕动泵，用0.02MpH 6.5磷酸盐缓冲液平衡层析柱，最少用3倍柱体积的0.02MpH 6.5磷酸盐缓冲液平衡，平衡过程中，调节蠕动泵的流速，记录柱下端流出速度，使之在 1-2ml/min之间。始终保持柱床上边最少有2cm高度的缓冲液，注意不能干柱，否则需重新 装柱。平衡过程中，调试核酸蛋白监测仪。首先将旋钮拨到T100%（指透光率），调“光量”到 显示100，再将旋钮拨到A （吸光度）（A有不同灵敏度，一般选择0.5A），调节“调零”到 显示0。继续平衡，如数字有波动，反复调节几次，使A值保持示为0。2.5上样及洗脱：关掉蠕动泵，打开柱上端的螺扣，将柱床上边的缓冲液吸出，然后立

15、即贴壁加1ml样 品（粗提样品），使样品全部缓慢流入层析柱床内，立即加0.02M pH 6.5磷酸盐缓冲液到柱 床上边保持2cm高度。拧好柱上端的螺扣，打开蠕动泵，继续以相同的磷酸盐缓冲液进行平 衡，观察核酸蛋白监测仪的A值变化情况。当A值急剧上升时，计时，同时以试管收集对应 的流出液（核酸蛋白监测仪的样品池出口），每收集2ml，换一支试管，当A值上升到最高 值时，计时，下降到数值稳定时，可停止收集流出液，这部分流出液主要为溶菌酶、胰凝乳 蛋白酶抑制剂等杂蛋白。然后改用0.3M氯化钠-0.02M pH 6.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，同 样，当A值急剧上升时开始收集，计时，以试管收集对应的流出液（

16、核酸蛋白监测仪的样品 池出口），每收集2ml，换一支试管，当A值上升到最高值时，计时，下降到数值稳定时， 可停止收集流出液，这部分流出液多为具有抑制胰蛋白酶活性的的卵类粘蛋白，即部分纯化 的卵类粘蛋白，纯度相当于一般商品，即1毫克蛋白的产品能抑制近1毫克的胰蛋白酶，比 活力为10，000 BAEE单位/毫克蛋白，并含有少量抑制胰凝乳蛋白酶的抑制剂（Chymotrypsin inhibitor）每毫克产品能抑制a-胰凝乳蛋白酶的量小于0.03毫克。收集的部分纯化的卵类粘蛋白可直接用于活性和蛋白质浓度测定，一般情况下，由于 实验课时限制，洗脱流速较快，导致洗脱体积过大，需要蔗糖浓缩到2-3ml左右

17、，再对水透 析，最大体积不要超过5ml，活力测定前，要对0.1mol/L pH8.0 PB缓冲液透析，透析后测 量体积，为纯化后类粘蛋白的总体积。纯化后类粘蛋白的总体积（mL）纯化后在A280处吸光度值蛋白质浓度/（mg/mL）（三）酶活力测定：3.1胰蛋白酶的活力测定（BAEE法）以苯甲酰L精氨酸乙酯（benzoyl L-arginine ethyl ejtev简称BAEE）为底物，用紫外 吸收法测定。方法如下：（1）取2个石英比色池（带盖，光程为1厘米），分别加入25度预热的2.8毫升BAEE-0.05M pH 8.0 Tris-HcL缓冲液（含氯化钙），然后想一个池中加入0.2毫升0.0

18、5M Tris-HcL缓冲 液，混合，作为空白对照，调零。另一池加入0.2毫升酶液（用量一般为10微克蛋白的结 晶酶），立即混匀并计时，于253nm处测其光密度（增加），每隔半分钟读一次数，共35 分钟。若 OD/分钟0.400，则酶液需要稀释或减量。时O X间D D 、min0.5minmin1.5minmin2.5minmin3.5minmin4.5min吸光度值（nm）酶活力单位胰蛋白酶活力卵类粘蛋白的抑制活力（2）根据时间一光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔与相应光密度值变化（AOD），按一下公式计算胰蛋白酶的活力单位和比活力。酶活力单位（BAEE单位）=AOD t/t*0.0

19、01比活力=酶活力单位/毫克蛋白质=AOD t/t*1000/ *t*0.001式中AOD t/t为任选的时间隔（分）内光密度值的变化（增加），为测定时所用酶蛋白量 （微克）；1000为酶蛋白由微克换算成毫克的转换值；0.001为光密度增加0.001定为1个 BAEE活力单位的常数。比活力=酶活力单位数/毫克蛋白质=AOD t*1000/ *t*0.0013.2卵类粘蛋白抑制活性测量：抑制1个胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）所需卵类粘蛋白量定为抑制剂的一个活力单位。（1）将卵类粘蛋白和结晶胰蛋白酶按一定比例相互混合,（卵类蛋白量不能超过胰蛋白酶量， 一般以1：2较适合，具体视卵类粘蛋白的纯度而

20、异）加入适量的0.05MpH6.0Tris-HcL-NaCL 缓冲液在25保温10分钟左右，使酶与抑制剂充分结合。（2）然后取适量混合液（相当于原胰蛋白酶10微克左右）按上述方法测出胰蛋白酶活力， 由它减去剩余酶活力，即为被抑制的胰蛋白酶活力，也就是卵类粘蛋白的抑制活力。酶活力测定方法二：于石英比色皿1中加入0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液3mL，作为空白。取2.9mL 在30C水浴锅中预热5min的BAEE-0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液于比色皿2中测定起 始值，为0。加入100uL胰蛋白酶溶液，迅速颠倒混匀。放入紫外分光光度计中，每隔30s 读

21、取一个A253，记录5min.计算胰蛋白酶活性。取2.8mL在30C水浴锅中预热5min的 BAEE-0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液于比色皿2中测定起始值，为0。加入100uL胰蛋 白酶溶液和100uL上步纯化的粘蛋白溶液，迅速颠倒混匀。放入紫外分光光度计中，每隔 30s读取一个A253，记录5min.计算胰蛋白酶活性。计算粘蛋白的抑制活性。（四）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量（1）安装电泳仪器（2）配胶：确定所需凝胶溶液体积，在一小烧杯中按表1从上到下的顺序配制分离胶溶液。 一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速混匀，迅速将凝胶溶液灌注在玻璃板的缝

22、隙 内。一般地，使凝胶液面达玻璃板垂直高度的3/4,上面的1/4留待灌注浓缩胶。最后用微 量进样器将100uL水加在胶的液面上，约2-3mm厚，以隔绝空气中的氧气，解除对凝胶聚合 作用的抑制。表1 10%分离胶的配制总体积5mL7mL30%胶母液（mL）1.652.3pH8.9buffer含SDS 、 TEMED(mL)1.251.75尢离子水（mL）2.12.9510%APS(uL)4060（3）待分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。（4）制备浓缩胶：按表2给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合。表2 3

23、.6%浓缩胶的配置总体积2mL30%胶母液（mL）0.24pH8.9buffer含SDS 、 TEMED(mL)0.5尢离子水（mL）0.910%APS(uL)30在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，注意梳子的正 反面，小心避免混入气泡，再将剩余的浓缩胶溶液填满梳子之间的空隙，室温放置待凝。（5）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，将待电泳分析的样品（本实验样品为鸡卵类粘蛋白粗品、鸡卵类粘蛋白纯品、标准蛋白质Marker）0样品的稀释取粗品粘蛋白（记为C）5uL和45uL水混匀，得溶液q。纯化粘蛋白记为P。制备样品50uL的q和50uL上样液混匀，30uL的C和

24、30uL的上样液混合，30uL的P和30uL的 上样液混合，10uL BSA和10uL上样液混匀，对上述的四个样品及Marker蛋白煮沸5min。表三点样顺序及点样量点样孔12345678910样品粗品粗品粗品粗品MarkerBSA纯品纯品纯品纯品点样量（uL）15105210205101520（6）浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子（如使用六一电泳槽，注意务必将凝胶 底部的橡胶条取出！）。把凝胶玻璃板重新固定于电泳装置上，正负极槽各加入丁口，-甘氨酸 电极缓冲液，负极槽的缓冲液一定要没过胶面，而正极槽的缓冲液只要没过电极丝即可。必 须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡！（7） 按上表顺序加样，加样量通常为1025l （1.5mm厚的胶）。（8）以电极线将电泳槽与电泳仪电源相接，注意黑色对应黑色（负极），红色对应红色（正 极），调节电泳仪电源的电压旋钮，样品在浓缩胶时，（百晶）恒压150V,（六一）恒压90V， 样品进入分离胶后，（百晶）恒压200V,（