细胞工程学复习资料迟长凤

1、细胞工程学1.细胞工程指以细胞为研究对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目地利用或改造生物遗传性状，以获得特定细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术 2 .显微操作术借助显微操作仪和微针。微吸管等工具实现细胞操作和研究的一种技术.细胞培养指从组织分离细胞，模拟体内环境，在无菌，适当条件下使其生长繁殖的一种技术.原代培养直接取材于有机体组织的细胞进行培养传代培养把原代培养的细胞从培养瓶中取出进行培养.细胞工程的研究对象：动物、植物、微生物.发现鸡神经元在生理盐水中可以存活，并使用了 “组织培养” 一词一一Rou x卢克斯分离蝌蚪神经组织，开创动物组织培养先河一一Ha r ris

2、 o n哈里森.植物组培奠基人：Wen t , Gauthe r e t, N obercount.第一个体外受精动物一一试管兔发一张明觉仓鼠肾细胞的悬浮培养，为动物细胞大规模培养技术的建立提供了基础一一C ap stick.Ca r 1 s o n 用NaNO3作为融合诱导剂进行 烟草原生质体融合，获得世界第一个体细胞 杂种植株.成功利用胚胎细胞克隆出一只绵羊，首次证实的通过核移植技术克隆的哺乳动物一一Villadse n多莉羊一一证明高等动物体细胞 细胞核的全能性.血细胞计数板使用方法.单细胞的获得：有限稀释法、显微操作分离法、流式细胞仪分离法、激光捕获纤维切割、 免疫磁珠分离.细胞保存方

3、法：传代培养保存法低温冷冻保存法:a低温彳存（-20 C左右）b 超低温保存（液氮-1 96 C）1 4 .细胞培养方式：分批式、流加式、半连续式、连续式、灌流式1 5 .分批培养的5个时期：适应期：c ell很少分裂，营养不消耗平台期：ceH浓度max,生长静止指数生长期：maxV生长，细胞浓度指数增长衰退期:ce 1 l开始自溶，死亡减速期：ce 1 l生长受抑制，V生下降.外植体指用于离体培养的植物或组织切段.人工种子指将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中形成的类似种子的颗粒1 8 .植物组织培养的应用：快速繁殖、种苗脱毒、突变育种、基因工程育种

4、、远缘杂交19.常用生长素（根）：口引味乙酸（IAA）、2, 4二氯苯氧乙酸（2,4D）、蔡乙酸（NAA）、口引味 丁酸（IB A）常用细胞分裂素 （芽）：6-节氨基喋吟（BA）、6 味喃氨基喋吟（激动素 KT） 生长素/细胞分裂素：高（根的形成，愈伤组织的形成 ）中（根芽分化）低（芽的分化） 2 0.人工种子三大结构：人工种皮外层、人工胚乳、胚状体或芽.胚状体同步发育的调节方法 （5种）:抑制剂法、低温法、渗透压法、通气法、分离筛选法.细胞工程的应用领域及各领域的技术细胞工程的应用领域非常广泛，涉及农业、食品、医药、化工与能源等许多方面。主要可分为四块，如下：）动植物快速繁殖指采用细胞工程技

5、术实现优良动植物快速繁殖以及濒危物种的保护。主要技术：组织培养植物、人工种子、试管动物、克隆动物等）新品种的培育与细胞重组指通过细胞工程技术对现有生物的遗传性状进行改良和培育新型物种。主要技术 ：原生质体诱变、细胞融合技术、细胞器水平上的细胞重组、染 色体水平上的多倍体、单倍体育种、雌（雄）核发育、胚胎嵌合等3）细胞工程生物制品指利用动植物细胞 、组织培养或转基因动植物反应器生产生物制品。主要技术：杂交瘤细胞培养大量制备单克隆抗体、动物细胞培养技术生产疫苗、生 长因子等4）细胞疗法与组织修复指利用培养的细胞或离体再造的组织修复受损细胞与组织或器官的技术。主要技术：干细胞与组织工程为核心的细胞工

6、程技术.体外受精指使哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术.细胞核移植一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术.显微受精技术（3种）：透明带下注射法、卵浆内精子注射法、透明带修饰法2 6.试管婴儿之父一一 罗伯特.爱德华兹世界首例试管婴儿一一路易斯.布朗国内首列一一郑萌珠27.控制X、Y精子方法：（1）酸碱法：X-酸,Y碱（3）流式细胞仪分离法：X上的口?人量丫（2）电泳法：Y的负电荷*的负电荷（4）离心分离法：Y的质量X（5 ）免疫学分离法：Y上存在H-Y抗原2 8 .体外受精动物与核移植动物的比较：体外受精动物：即试管动物，指供

7、体的精子和卵子在体外受精，在胚胎发育到一定阶段时， 通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。培育过程分5步：精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养，体外受精，重组胚激活与体外培养，胚胎移植，体内发育、出生优点:发挥优良母畜的繁殖能力，促进家畜改良速度，保存遗传资源，作为辅助技术缺点：胚胎体外发育阻滞，胚胎细胞数量少核移植动物：即核质杂种，利用显微操作术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的 去核成熟卵细胞内构建组胚，再通过胚胎移植移入受体完成发育出生过程的动物。培育方法分6步：核供体细胞获得与取核，受体细胞去核，细胞核移植，重组胚激活，重组胚培养和移植，核移植后代的鉴定优点：加快珍惜动物繁殖，

8、保存濒危动物，能克服远缘杂交、培育出优良品种，保持优良物 种缺点:技术复杂，对生物多样性提出挑战导致生物品系减少，个体生活力差.核供体细胞：1 5天的缺血饥饿培养，诱使细胞处于“静止”状态 ，进入GO期.细胞融合指使用人工方法使 2个或2个以上的细胞合并形成 1个细胞的技术3 1.原生质体去除细胞壁后裸露的球形细胞原生质体融合2 .细胞融合过程：亲本选择，粘附，形成细胞桥，胞质渗透、细胞核融合，融合细胞筛选.细胞融合方法：（1）生物法：病毒诱导细胞融合，如仙台病毒，不常用 化学法：NaNO3诱导鬲合，高pH的高浓度C?诱导融合，PEG诱导融合现在主要用高 Ca高pH和P EG结合诱导融合，融合

9、成本低，无需特殊设备 ，任何细胞都能融 合（3）物理法：电融合诱导法.融合细胞的筛选方法：细胞形态大小差异，选择性培养基筛选法，再生后植株与亲本形态性质差异.染色体工程按照一定的设计，有计划地消减、添加或替换同种或异种染色体从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术.染色体组生物体配子的全部染色体3 7.初级代谢产物指通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核甘酸、多糖、脂质维生素等3 8 .次级代谢产物指通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物。.植物细胞培养的特点(与微生物细胞相比)：(1)细胞直径比微生物大 30-10 0倍(2)细胞通常以一定数目

10、的非均相细胞团方式存在(3)细胞具有纤维素细胞壁和大的液泡很容易被剪切力损伤(4)细胞生长速度慢，操作周期长(5)细胞培养基成分营养丰富而复杂，适合微生物生长，防止污染更困难(6)细胞培养需光照，通过光合作用合成有机物.常规生物反应器：机械搅拌式生物反应器，气升式生物反应器，鼓泡式生物反应器，转鼓式生物反应器.分批式培养的细胞生长与产物的关系：生长偶联型，中间型，非生长偶联型.影响(提高)植物细胞培养生产次级代谢产物的因素及调控方法(途径)：提高次级代谢产物产量需考虑的因素有四个方面：细胞株，培养工艺，培养技术，培养设备植物细胞培养生产次级代谢产物包括两个重要环节，细胞生长和产物合成。这两个环

11、节的任何影响因素都能影响生产率。具体因素可分为生物，物理，化学因素生物因素：细胞株特性，稳定高产生长速度快的细胞株是细胞大规模生产代谢产物的前提。细胞凋亡，通过采用合适的培养工艺来保证充足的营养供给以及避免有害代谢产物的积累，如半连续培养法。细胞团，选用合适的生物反应器减小因细胞团容易受剪切力影响而破碎，引起培养液黏度增加，气体交换与传递受到的影响。生物合成机制。化学因素：营养盐，确保植物细胞生物量的增长， 同时细胞能合成积累次级代谢产物。 前 体，前体的加入刺激细胞中特定酶，促使次级代谢产物量的增加。诱导子。反馈抑制，采用流加式培养法克服反馈抑制。物理因素：光照，温度，pH其他因素：培养液的

12、流变特性 ，气体传递，搅拌与剪切力，泡沫与器壁表面黏附性.动物细胞培养模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术4 4.细胞系由原代培养经传代培养纯化，获得的能在体外生存的细胞群体细胞株 指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群 4 5.微载体直径602 5 0 u m的适用于贴壁依赖型细胞生长的微珠。46.维茨尔(van Weze l)开发了微载体系统卡尔雷Ca rre 1设计卡氏瓶4 7 .微载体分类：实心微载体，多孔微载体.理想微载体的特征：(1)良好的生物相容性，无毒无害(2)好的黏附性，一般带有正电荷(3)大的比表面积，

13、颗粒均匀，孔径均一(4 )良好的传质性能(5)强的机械强度，能保护细胞，方便清理，重复利用.动物细胞体外生长特点（与微生物相比）（1）细胞比微生物细胞大，无细胞壁，对机械搅拌或剪切力敏感（2）细胞生长缓慢，易受污染（3）正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞或发生转化的细胞才能无限生长下去（4）细胞间主要以聚集体形式存在，大多需要贴附在载体表面才能生长，且有接触性抑制和密度抑制.贴附型细胞可分为4类:成纤维型细胞，上皮型细胞，游走型细胞，多形型细胞.动物细胞培养天然培养基中血清的作用：（1）提供生长因子（3）提供细胞贴附因子和展开因子（2）补充营养成分（4）作为缓冲系统，保护细胞免受损伤5 2

14、.单克隆抗体的制备 步骤：（1 ）动物免疫与免疫脾细胞制备：体外法，体内法（2）骨髓瘤细胞的获得与培养：多用B ALB/C小鼠的骨髓瘤细胞，通常采用HGPRT或TK缺陷型的骨髓瘤细胞。采用饲养层培养法促进杂交瘤细胞生长。采用HAT培养基做敏感性试验选择骨髓瘤细胞，其原理是：D NA的合成正常途径和补救途径两条，其中正常途径可被氨 基喋吟（A）阻断，补救途径可被 HGPRT和TK这两种酶阻断。H AT选择培养基中含有次黄 喋吟（H）、氨基喋吟（A）、胸腺喀咤核甘（T）,瘤细胞是HGPRT或TK缺陷型细胞，所以 DNA合成途径被阻断，死亡。而融合细胞具有来自B细胞的HG PRT与T K,所以能采用

15、补救途径合成DNA成活繁殖。（3）细胞融合：采用PEG （聚乙二醇）诱导细胞融合法。 骨髓瘤细胞与脾细胞按 1:10或1:5 比例混合在一起。（4）细胞融合后筛选：先HA T培养液培养，再HT培养基，最后 RPMI 164 0培养液培养 （5）分泌抗体细胞的鉴定与筛选 ：以快速，简便，特异，敏感为原则。筛选方法有ELISA,放射免疫法测定等（6）杂交瘤细胞克隆化培养（7）单克隆抗体的大量生产：实体瘤法，腹水制备法，生物反应器.干细胞SC 一类具有自我更新和分化潜能的细胞. S C特征：（1）自我更新特征：可通过对称分裂和不对称分离两种方式进行（2）增殖特征：缓慢性与自稳性（3）分化特征：可分为

16、单能干细胞（如表皮干细胞），多能干细胞（如骨髓造血干细胞），全能干细胞（如胚胎干细胞）5 5.ESC与A SC的优缺点比较：ES C:从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞 优点：无限分化潜能缺点：（1）来源限制，（2）伦理道德问题，（3）体外培养困难（ESC分化机制不清楚，控制其分 化的抑制技术有待完善，例如饲养层细胞与条件培养基还不成熟），（4）安全性无法保证，免疫排斥（ES C分化为多向，且无法控制其分化方向。S C移植后成瘤性风险较大。异体移植能引 起免疫排斥）A SC成体组织内具有进一步分化潜能的细胞，是多能或单能干细胞优点：（1）来源方便，（2）无

17、伦理道德问题，（3）比较安全，避免免疫排斥反应（AS C通过采取 自身供体细胞核通过治疗性克隆得到自身胚胎干细胞，但克隆技术并不成熟）缺点：（1）ASC含量极少（ASC在组织中含量极少，且缺乏特异性检测标志，很难从组织中分离 纯化），（2）体外传代易表型改变 （AS C在体外长期传代后会发生表型改变， 且AS C也参与 肿瘤的形成),(3)AS C可塑性机制不清楚，(4)无维持ASC未分化状态的技术.组织工程利用生命科学、医学、工程学的原理与技术，利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术.细胞外基质指细胞合成分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，对细胞形态和活性有重要作

18、用.组织工程的三要素：种子细胞，支架材料，细胞因子9 .支架结构的特点及分类特点：良好的生物相容性，良好的生物降解性，合适的三维立体结构，好的加工性与一定 的机械强度，良好的消毒性能分类：有机材料(原、壳聚糖、透明质酸等 )，无机材料(氧化铝陶瓷、碳纤维、生物活性玻 璃陶瓷等，生物复合材料(聚乳酸 PLA和聚羟基乙酸PG A的聚合物、聚乳酸-己内酯的共 聚物PLC)0 .细胞生长因子的类型及功能(1 )转移生长因子-3 (TGJ 3 )，可调节细胞增殖。分化与细胞外基质分泌，参与炎症和组织 的修复(2)骨形态发生蛋白(BMP),能诱导骨，软骨的形成(3)成纤维细胞生长因子(FGF，可诱导血管化，骨形成并促进神经再生(4)表皮生长因子(EG F ),能促进伤口愈合，体外刺激角化细胞分裂，体内促进上皮再生(5)神经生长因子(NGF),有保护神经元，促进突起生长等生物学功能(6)肝细胞生长因子(HGF)刺激多种上皮和内皮细胞进行有丝分裂、运动，促进肾小管形态发生，在肾的发育再生，组织器官损伤修复过程中发挥重要作用。6 1 .细