试验三简单染色法和革兰氏染色法

1、实验三简单染色法和革兰氏染色法（一）细菌的简单染色法1实验目的熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能学习微生物涂片、染色的基本技术掌握细菌的简单染色法初步认识细菌的形态特征，学习油镜的使用方法和无菌操作技术2实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明,在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进 行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差， 从而能更清楚地观察到其形 态和结构。此法操作简单，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。一般使 用碱性染料进行简单染色。碱性染料的离子带正

2、电荷，能和带负电荷的物质结合。 因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电 荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的燃料有美 蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸 使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果 红等酸性染料着色。染色前必须固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；二是增加对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维 持细胞原有的形态。3实验材料

3、菌种金黄色葡萄球菌约18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物。染色剂草酸俊结晶紫染液，番红染液。仪器或其他用具显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签等。4流程涂片 一干燥一固定一染色一米洗一叶燥一镜检5步骤涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴生理盐水或无菌蒸储水，用无菌操作方法2从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约11.5cm若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2-3环直接涂布于载玻片上。注意生理盐水（蒸储水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。干燥室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太

4、近，因温度太高会破坏菌体形态。如用加热干燥，固定与干燥合为固定手执载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火23次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏（图 410c） 0染色将涂片平放于玻片搁架上，滴加1-2滴染色液覆盖于涂菌处，染色约2min（图410d） 0水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止（图4-10e）o干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体 （图4 10f）。镜检待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。

5、6结果绘制单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。（二）革兰氏染色法1目的了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜的使用方法。2原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram 氏创立的，革兰 氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两 大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后 用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞 保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂

6、被脱色剂洗脱而使 细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌 （G ）和革兰氏阴性菌（G 十 ）两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G-菌和G +菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为 媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了燃料与细菌的结 合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。 革兰氏阳性细菌的细 胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮） 脱色时细胞壁脱水、使

7、肽聚糖的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫 - 碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。 革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使得结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。3材料菌种金黄色葡萄球菌约18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养 物。染色剂草酸俊结晶紫染液，番红染液。仪器或其他用具显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签等。4流程涂片一干燥一固定一染色（初染、媒染、脱色、复染）一镜检5步骤涂片常规

8、涂片法取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴 一小滴蒸储水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净 无油，否则菌液涂不开。“三区”涂片法在玻片的左、右端各加一滴蒸储水，用无菌接种环挑取少量金黄色葡萄球菌与 左边水滴充分混合成仅有金黄色葡萄球菌的区域， 并将少量菌液延伸至玻片的中 央。再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央， 与金黄色葡萄球菌相混合含有 两种菌的混合区，干燥、固定。要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色 ；涂片 不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。初染滴加结晶紫（以刚

9、好将闲膜覆盖为宜）于两个玻片的涂面上，染色1min，倾去 染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。媒染用卢戈氏碘液媒染约1min ,水洗。脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足, 阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约 20-30S 。复染在涂片上滴加番红液复染约2-3min,水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过 程中，不可使染液干涸。干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰 氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。实验结束后处里清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用接镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用6结果根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。列表简述两株