转基因产品通用检测方法及数字PCR技术介绍进展

1、转基因产品通用检测方法及数字PCR技术介绍进展一、转基因产品通用检测方法二、转基因产品数字PCR技术三、转基因产品快速检测技术主要内容一、转基因产品通用检测方法主要内容转基因成分检测策略筛选PCR是所有检测策略中检测范围最广的检测方法，可以快速的对样品中的转基因成分进行初筛。转基因成分检测策略筛选PCR筛选PCR检测目标区域为外源插入片段的通用元件，这种检测策略可以对样品中的转基因成分进行初筛。由于不同的转基因品系通常含有不同的筛选元件，因此，筛选元件的种类决定了筛选PCR检测结果的可信度。通过收集全球已经商业化的转基因作物，对所有转基因品系中的筛选元件进行分析。挑选出了可以覆盖全部转基因品系

2、的筛选元件组合。转基因成分检测策略筛选PCR在所有的391个转基因品系中，单一品系占了253项，其中，主要进出口货物玉米、大豆、油菜、棉花、土豆以及甜菜等物种占比较大（150/253）虽然转基因作物总数较多，但是其中绝大部分品系都没有实现商业化（黄色vs蓝色）。MAIZECOTTONPOTATOCANOLASOYBEAN本课题组通过与转基因作物研发单位进行交流沟通，得到了所有已经商业化转基因作物的转化图谱以及外源插入序列，并在此基础上，我们进行了转基因品系筛选元件覆盖度的分析。1775451通过与全球各大转基因研发公司达成数据转让协议，共获得包括玉米、大豆、油菜、甜菜、苜蓿在内的35种转化事件

3、。通过收集资料，获得其余17种转化事件的插入信息。通过高通量测序，获得14中转化事件的插入信息。转基因成分检测策略筛选PCR插入信息收集挑选基因多序列比对特异性分析转基因成分检测策略筛选PCR灵敏度分析高通量检测方法/国家标准转基因成分检测策略筛选PCRCaMV 35s启动子NOS终止子CaMV 35s终止子pat基因PINII基因E9基因Rbc基因CaMV 35S启动子多序列比对结果转基因成分检测策略筛选PCR对于筛选元件中的可变序列，本课题组进行了不同品系之间的比对。转基因成分检测策略筛选PCR除了以上筛选元件覆盖的转基因品系之外，还有三种转基因品系是没有任何筛选元件的（DAS40278,

4、 DP305423, CV127），因此我们在筛选元件的组合中，加入了三种转化事件引物探针。转基因成分检测策略筛选PCR7个筛选元件3个转化事件内标准基因商业化转基因产品转基因成分检测策略筛选PCR商业化转基因转化事件全覆盖灵敏度达到0.1%，与欧盟转基因检测限一致比行业标准更高的元件覆盖度（如Topas19/2）现行行业标准能满足商业化事件的转基因成分检测转基因成分检测策略筛选PCR转基因成分检测策略筛选PCR持续增长的转基因品系筛选PCR配套阳性物质三、转基因产品数字PCR技术发展历程第一代PCR基于凝胶电泳的PCR第二代PCR基于扩增曲线的定量PCR第三代PCR基于分割体系的绝对定量PC

5、R精准检测技术数字PCR发展历程第一代PCR基于凝胶电泳的PCR最基础的分子生物学鉴定技术，是所有PCR检测技术的基础。发展历程第一代PCR基于凝胶电泳的PCR发展历程第一代PCR基于凝胶电泳的PCR优势缺陷操作简便，价格低廉对扩增仪器要求低灵敏度较低结果判读依赖人为因素扩增后开盖检测，易产生实验室污染发展历程第一代PCR基于凝胶电泳的PCR随着实验技术的发展以及对检测灵敏度要求的提高，定性PCR已经逐渐退出了转基因成分检测的历史舞台。虽然现阶段的转基因标准还是以定性检测为主，但是定量PCR已经越来越多的应用于转基因检测中。发展历程第二代PCR基于扩增曲线的定量PCR定性PCR的深化，灵敏度和

6、结果判读方面有了较大的提高。发展历程第二代PCR基于扩增曲线的定量PCR发展历程第二代PCR基于扩增曲线的定量PCR优势缺陷操作简单，结果判定容易扩增稳定性强受到扩增基质效应的影响定量检测较为困难判读不受人为因素影响发展历程第二代PCR基于扩增曲线的定量PCR虽然定量PCR具有较好的定量能力，但是现阶段绝大多数的标准都是用这种方法进行定性检测的。发展历程第二代PCR基于扩增曲线的定量PCR梯度稀释误差扩增曲线误差标准曲线误差发展历程第二代PCR基于扩增曲线的定量PCR多种因素产生的误差导致定量PCR在转基因成分的定量鉴定方面具有明显的局限性，比如定量稳定性较差，定量灵敏度较低等。因此，开发以及

7、应用更加简便的定量检测技术是转基因成分定量检测的趋势和必经之路。发展历程第三代PCR基于分割体系的绝对定量PCR1999年，Bert等人通过将原始定量PCR的体系进行分割，提出了一种新型的依赖于计数的核酸定量检测策略。这种策略理论上可以不依赖于标准曲线进行核酸的绝对定量。该种检测策略成为了数字PCR的雏形。数字PCR简介DNA2W-2000W个反应体系数字PCR数字PCR是一种新型的核酸信号的定量检测手段。与传统的定量PCR相比，数字PCR具有不依赖于标准曲线绝对定量以及单拷贝检测的优势。精准检测技术数字PCR数字PCR简介Digital PCR是一种基于单分子模版PCR扩增，无需使用标准曲线

8、，对样品核酸进行定量的分析方法。通过对阳性PCR反应和阴性PCR反应的计数，来计算目标分子的绝对数目。精准检测技术数字PCR数字PCR简介通过阴性体系和阳性体系的数量，根据泊松分布，即可计算得出反应中目的片段的绝对拷贝数。精准检测技术数字PCR数字PCR分类市面上常见的数字PCR平台按照微滴分割方式来说，主要分为微滴式平台和芯片式平台。Vs精准检测技术数字PCR数字PCR分类芯片式数字PCR芯片式数字PCR平台是依靠微流控芯片进行原始体系分割的。这种分割方法通常具有较高的分割稳定性，体系之间的影响较小，因此反应之间稳定性较高常见芯片式数字PCR平台包括Fluidigm BioMark平台以及Q

9、uantStudio 3D平台 数字PCR分类 Fluidigm BioMark平台 最原始的数字PCR平台，开创了芯片式数字PCR的先河；唯一一种可以对单孔中荧光信号进行实时检测的平台，可以产生单孔扩增曲线；其分支平台可以进行多基因的高通量检测；灵活性较差，只能进行规定数量的样品检测，耗材价格较为昂贵；分割产生体系数较少，较其余平台的检测来说，检测产生的不确定性较高；优势缺陷数字PCR分类 QuantStudio 3D平台 基于终点荧光检测法的芯片式数字PCR平台；物理芯片式的分割，可以极大的避免荧光信号之间的交叉干扰；生成微滴数较多，检测产生的不确定性较低；受制于检测平台，单次只能进行8个

10、芯片的同时检测，检测通量较低；操作较为复杂，单位样品操作时间较长；优势缺陷数字PCR分类微滴式数字PCR微滴式数字PCR平台依靠油包水结构进行原始体系分割。这种分割方法具有较高的反应灵活性以及反应效率，但是由于油包水结构的热胀冷缩，因此反应的稳定性一般不如芯片式数字PCR。常见微滴式数字PCR平台包括Bio-Rad QX100/200平台以及RainDance RainDrop平台（已被Bio-Rad收购） 数字PCR分类 Bio-Rad QX100/200平台 该平台的出现开创了微滴式数字PCR的先河；通过油包水进行反应体系分割，速度快，成本低，可以同时进行96个样品检测；操作简便，液体转移

11、步骤比较少，不易受到环境因素的干扰；油包水结构的稳定性是决定反应成败的根本，受这方面影响较大；扩增步骤通过PCR仪进行，较于其他平台，受基质效应影响明显；优势缺陷数字PCR分类 RainDance RainDrop平台 最新型的微滴式数字PCR平台，油滴分割技术较为成熟；单个反应体系可以生成2000万个小微滴，在所有平台中数量最高；仪器自动化水平高，液体转移步骤比较少，不易受到环境因素的干扰；微滴生成过程需要单独的加压装置，实验室占用面积较大；试剂耗材多为为封闭系统，耗材成本较高；优势缺陷数字PCR分类由于不同的数字PCR平台之间具有不同的体系分割数量，因此，对于跨平台之间数据的稳定性分析成为

12、了数字PCR数据分析的关键平台之间稳定性验证实验结果表明，不同数字PCR平台之间取得检测结果的平均值相对来说都比较稳定。但是由于体系分割数量的不同，每组之间的RSD值会有较为明显的差异。体系分割数量越大，实验结果的稳定性越高。数字PCR的优势1. 对于常规的real-time PCR, 样品与样品之间的比较基于一致的PCR扩增效率。Digital PCR则无需。精准检测技术数字PCR数字PCR的优势1. 对于常规的real-time PCR, 样品与样品之间的比较基于一致的PCR扩增效率。Digital PCR则无需。2. Digital PCR, 并不依赖阈值来决定靶目标的数量。Ct数字PC

13、R的优势1. 对于常规的real-time PCR, 样品与样品之间的比较基于一致的PCR扩增效率。Digital PCR则无需。2. Digital PCR, 并不依赖阈值来决定靶目标的数量。3. 可以检测单个靶目标分子，甚至是低浓度的混杂样品。 数字PCR的优势1. 对于常规的real-time PCR, 样品与样品之间的比较基于一致的PCR扩增效率。Digital PCR则无需。2. Digital PCR, 并不依赖阈值来决定靶目标的数量。3. 可以检测单个靶目标分子，甚至是低浓度的混杂样品。 4. 4.无需标准曲线进行绝对定量(copies per reaction)。数字PCR的优

14、势1. 对于常规的real-time PCR, 样品与样品之间的比较基于一致的PCR扩增效率。Digital PCR则无需。2. Digital PCR, 并不依赖阈值来决定靶目标的数量。3. 可以检测单个靶目标分子，甚至是低浓度的混杂样品。 4. 无需标准曲线进行绝对定量(copies per reaction)。5. 相对定量实验理论上更加准确。特别是在样品之间差异倍数不大的状态下，使用数字PCR 更为准确。Sample 1Sample 220% difference数字PCR的局限1、数字PCR通常具有较高的实验成本2、数字PCR对于操作者的专业性要求更高；较于常规PCR检测方法来说3、

15、数字PCR数据的处理以及分析有更高的要求；数字PCR研究进展数字PCR作为一种新型的分子生物学扩增技术，较于传统检测技术，具有灵敏度高，稳定性好，特异性强、可以绝对定量等优势，因此，现阶段，数字PCR在核酸信号的精准定性定量检测中已经取得了较为广泛的应用。本PPT将从不同方面着手，重点介绍一下数字PCR在不同领域中的研究进展。精准检测技术数字PCR数字PCR研究进展数字PCR转基因成分筛查检测 精确度高数字PCR特点研究内容 灵敏度好 稳定性好 针对我国数字PCR转基因标准检 测技术空缺 以常用的35s，nos两种筛选元件为研究对象 建立一套针对转基因作物筛查方法。实现了数字PCR在国内的首次

16、标准化应用数字PCR研究进展数字PCR转基因成分筛查检测不同数字平台具有良好稳定性不同平台间具有相同的检测效果数字PCR研究进展数字PCR转基因成分筛查检测内标准基因扩增稳定筛选基因为阳性的品系扩增稳定筛选基因为阴性的品系无扩增数字PCR研究进展数字PCR转基因成分筛查检测实验室间具有良好的稳定性本方法后续可以推广转基因成分筛查检测体系数字PCR研究进展数字PCR转基因品系绝对定量检测体系 精确度高数字PCR特点研究内容 灵敏度好 稳定性好 针对我国数字PCR转基因定量检测标准技术的空缺 以常见的7种转基因玉米品系为研究对象 建立一套针对转基因作物品系定量检测方法。为后续数字PCR技术的标准化

17、奠定了理论基础绝对定量不依赖标曲数字PCR研究进展数字PCR转基因品系绝对定量检测体系节约成本，定量数字协同分析选取扩增曲线均匀的组合用于后续定量实验内参外源组的扩增曲线均一易分析数字PCR研究进展数字PCR转基因品系绝对定量检测体系数字PCR研究进展数字PCR转基因品系绝对定量检测体系品系内扩增稳定品系之间无交叉扩增所有引物探针特异性好数字PCR研究进展数字PCR转基因品系绝对定量检测体系在测定浓度（100-0.5%）中，所有品系具有良好的线性稳定性数字PCR研究进展数字PCR转基因品系绝对定量检测体系对所有品系的0.5%质量百分比的样品稳定定量；0.1%组有阳性扩增产生；绝对灵敏度可以达到

18、单拷贝。数字PCR标准化虽然数字PCR较于传统的检测技术有众多的优势，但是如果没有标准方法支持的话，数字PCR的推广就会相当困难。因此，我们课题组于2014年开始筹备数字PCR转基因标准的开发，并于今年年初实现了国内首个数字PCR标准的发布。精准检测技术数字PCR数字PCR标准化本标准中，以数字PCR作为检测手段，以不同的筛查元件作为检测目的片段，实现了对现行绝大多数商业化品系的覆盖检测。本标准作为国内首个批准的转基因国家标准，对数字PCR的推广具有重要的价值和意义。三、转基因产品现场快速检测技术1990年，Nucleic Acids Research上率先发表了Mercier等关于血液的直接PCR技术的论文。商业化企业也取得了进展，Thermo和Takara公司先后推出了能够直接利用植物叶片组织一步提取基因组DNA，并结合高耐受性聚合酶进行扩增的试剂盒。与此同时，Envirologix公司也推出了基于NEMA的针对部分病原微生物的等温扩增试剂盒。61现场快速检测技术直接扩增技术存在的问题植物组织由于存在细胞壁，干扰物质复杂，种子中存在高脂、高淀粉或者高蛋白的各种不同复杂情况，直接提取试剂和方法的开发一直很滞后。以上的试剂盒均未充分考虑检测对象的复杂性，仅能对最常见的叶片组织和少量检测对象进行检测未考虑真菌等情况，也未充分