青霉素发酵生产工艺

1、青霉素及其发酵消费工艺1.青霉素简介 发现 化学构造 理化性质 抗菌作用和临床运用青霉素发酵消费工艺 菌种 发酵工艺流程 培育基 发酵培育控制 提取精制 2.青霉素的发现 1928年，英国细菌学家Fleming发现污染在培育葡萄球菌的双蝶上的一株霉菌能杀死周围的葡萄球菌。他将此霉菌分别纯化后得到的菌株鉴定为青霉，并将这菌产生的抗生物质命名为青霉素。3.1940年，英国Florey和Chain进一步研讨此菌，并从培育液中制出了枯燥的青霉素制品。经实验和临床实验证明，它毒性很小，并对一些革兰氏阳性菌所引起的许多疾病有杰出疗效。4.青霉素类抗生素青霉素(Penicillin)又称盘尼西林，是人类发现

2、的第一种抗生素，也是目前全球销量最大的抗生素。青霉素是-内酰胺类抗生素中的一类，是分子中含有青霉烷、能破坏细菌细胞壁并在细菌细胞的系列生长期起杀菌作用的一类抗生素。一种高效、低毒、临床运用广泛的重要抗生素。它的研制胜利大大加强了人类抵抗细菌性感染的才干，带动了抗生素家族的诞生。5.青霉素的化学构造 青霉素是-内酰胺类抗生素中的一类，具有-内酰胺环构造；是分子中含有青霉素母核青霉烷的多种化合物的总称。分子构造球棍模型-内酰胺环6-氨基青霉烷酸6. 青霉素类抗生素 青霉素G 青霉素X 青霉素V 霉菌属的青霉菌发酵液中提取，天然青霉素有多种G、V、N、K、X、其中PG的活性最高、产量最高 。 青霉素

3、N 青霉素K7.青霉素理化性质一元有机酸普通的羧酸 Pka 4-6PG Pka 2.7解离常数8.不稳定性 内酰胺环是青霉素中最不稳定的部分，缘由： 1、四元环和五元环稠合，环的张力大 2、两个环不在同一平面，青霉素构造中-内酰胺环中羰基和氮原子的孤对电子不能共轭， 易遭到亲核性或亲电性试剂的进攻，使-内酰胺环破裂。-内酰胺环对水、光、热、酸、碱、酶、醇、胺不稳定，-环开裂、活性降低或消逝9.对碱或酶(-内酰胺酶)不稳定，水解10.对稀酸不稳定，发生重排；PH=4青霉二酸青霉醛青霉胺-CO2对羰基亲核反响分解重排11.对强酸不稳定，发生重排 PH=2 or HgCl2 青霉酸 + 青霉醛酸 青

4、霉醛a-环开裂,-CO2abb12.青霉素的理化性质青霉素本身为一元有机酸，可与钾、钠、镁、钙、铝和铵等化合成盐类。青霉素游离酸易溶于醇、酸、醚、酯等普通有机溶剂，但在碳氢化合物中溶解度很小；在水中溶解度也很小，且会迅速丧失抗菌才干。青霉素金属盐类极易溶于水；几乎不溶于乙醚、氯仿、醋酸戊酯，略溶于乙醇、丁醇、酮类和醋酸乙酯。青霉素钠盐、铵盐、钾盐吸湿性依次减小，钠盐比钾盐更不易保管。青霉素游离酸不耐热，普通保管于冰箱中；但青霉素盐的结晶纯品，稳定性很好，在枯燥条件下可于室温保管数年。 青霉素钾盐结晶，150 加热1.5h效价无影响，因此结晶青霉素可干热灭菌。青霉素临床上普通用其钠盐、钾盐或普鲁

5、卡因盐，加强水溶性。 粉针剂，有效期2年 临床用粉针剂，现用现配13.抗菌作用和临床运用青霉素主要抑制革兰氏阳性细菌，但对某些革兰氏阴性细菌，螺旋体及放线菌也有较强的抗菌作用。青霉素的抗菌作用与抑制细胞壁的合成有关。青霉素临床上用于治疗葡萄球菌传染症如脑膜炎、化脓炎、骨髓炎等，溶血性链球菌传染症如腹膜炎、产褥热，以及肺炎、淋病、梅毒和炭疽等。14.青霉素的运用溶血性链球菌感染。肺炎链球菌感染。不产青霉素酶葡萄球菌感染。炭疽。破伤风、气性球疽等梭状芽孢杆菌感钩端螺旋体病。流行性脑脊髓膜炎。放线菌病。淋病。除脆弱拟杆菌以外的许多厌氧菌感染。青霉素与氨基糖苷灯药物结合用于治疗草绿色链球菌心内膜炎。1

6、5.青霉素发酵消费工艺16.17.青霉素制备的普通流程图菌种孢子制备种子制备发酵发酵液预处置及种子加滤提取及精制废品检验废品包装前体发酵阶段提取精制18.菌种 目前国内青霉素消费菌按其在深层培育中菌丝的形状分为丝状菌和球状菌两种，根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和绿孢子丝状菌，常用菌种为绿孢子丝状菌，如产黄青霉素。19.菌种 青霉素最初消费菌为音符型青霉菌，消费才干仅为几十个单位，不能满足工业消费需求。后来发现适宜深层培育的新菌种产黄青霉，消费才干100U/ml，经不断诱变选育，目前平均消费才干66000-70000U/ml，国际最高消费才干已超100000U/ml。20.青霉素产生

7、菌的生长过程分生孢子发芽期菌丝繁衍期脂肪粒构成期脂肪粒减少，小空孢大空孢自溶菌丝生长期青霉素分泌期菌丝自溶期21. 14期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子。45期为消费期，消费才干最强，经过工程措施，延伸此期，获得高产。在第六期到来之前终了发酵。22.青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、青霉素合成和菌体自溶三个阶段。菌体生长阶段：发酵培育基接种后消费菌在适宜的环境中经过短时间的顺应，即开场发育、生长和繁衍，直至到达菌体的临界浓度。 青霉素合成阶段：这个阶段主要合成青霉素，青霉素的消费速率到达最大，并不断维持到青霉素合成才干衰退。在这个阶段，菌体分量有所添加，但产生菌的呼吸强度普通无显著变

8、化。菌体自溶阶段：这个阶段菌体衰老，细胞开场自溶，合成青霉素才干衰退，青霉素消费速率下降，氨基氮添加，PH上升。23.丝状菌三级发酵工艺流程冷冻管25C，孢子培育，7天斜面母瓶25C，孢子培育，7天大米孢子26C，种子培育56h一级种子培育液27C，种子培育，24h二级种子培育液2726C,发酵,7天发酵液。24.青霉素发酵过程青霉素发酵时，青霉素消费菌在适宜的培育基、PH、温度和通气搅拌等发酵条件下进展生长并合成青霉素。发酵开场前，有关设备和培育基主要是碳源、氮源、前体和无机盐等必需先经过灭菌，后接入种子。在整个过程中，需求不断通气和搅拌，维持一定的罐温暖罐压，在发酵过程中往往要参与泡沫剂，

9、假设酸碱控制发酵液的PH，还需求间歇或延续的参与葡萄糖及铵盐等化合物以补充碳源及氮源，或补进其他料液和前体等以促进青霉素的消费。25.青霉素的发酵发酵工艺控制： 1.基质浓度 2.培育基成分的控制 3.温度 4. pH 值、溶氧 5.菌丝形状 6.泡沫的控制26.发酵工艺控制 1.基质浓度 ： 在发酵过程中，经常由于前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑制如葡萄糖的阻遏和抑制 , 苯乙酸的生长抑制, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成 。 所以， 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 ，以维持一定的最适浓度 。27.发酵工艺控制2.培育基成分的控制 : A.碳源：

10、发酵中常用乳酸或葡萄糖。 乳糖最为廉价，但因货源较少，很多国家采用葡萄糖替代。但当葡萄糖浓度超越一定限制时，会过分加速菌体的呼吸，以致培育基中的溶解氧不能满足需求，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在菌体或培育基中，导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。 目前普遍采用淀粉的酶水解产物，葡萄糖化液流加，以降低本钱。28.发酵工艺控制B.氮源： 主要有机氮源为玉米浆、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。 玉米浆为较理想的氮源，含固体量少，有利于通气及氧的传送，因此利用率较高。 有机氮源还可以提供一部分有机磷，供菌体生长。无机氮如硝酸盐、尿素、硫酸铵等可适量运用。29.

11、发酵工艺控制C.无机盐： 碳酸钙用来中和发酵过程中产生的杂酸，并控制发酵液的pH值 为菌体提供营养的无机磷源普通采用磷酸二氢钾。 另外参与硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所需的硫。 铁离子对青霉素有毒害作用，应严厉控制发酵液中铁含量在30ug/mL以下。如今还有一些工厂采用铁罐发酵，在发酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液；发酵时间愈长，那么铁离子愈多。铁离子在50g/ml以上便会影响青霉素的合成。所以青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜。30.发酵工艺控制D.前体： 前体的参与是青霉素发酵的关键问题之一。 添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基转移的作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉素G的消费强度

12、。 但苯乙酸对发酵有影响，普通以苯乙酰胺较好。 也有采用苯乙酸月桂醇酯，其优点是在发酵中月桂醇酯水解，苯乙酸结合进青霉素废品。而月桂酸作为细菌营养剂及发酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价钱较贵。 前体要在发酵开场20h后参与，并在整个发酵过程中控制在50g/ml左右。前体用量大于0.1%时，青霉素的生物合成均下降。所以普通发酵液中前体浓度以一直维持在0.1%为宜。31.发酵工艺控制3.温度 ： 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同能够稍有差别 , 但普通以为应在25 C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 , 同时添加葡萄糖的维持耗费 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说

13、 , 最适温度不是一样的, 普通前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达消费阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。 32.发酵工艺控制4. pH 值、溶氧 ： pH值：青霉素发酵的最适pH 值普通以为在6.87.2 左右, 应尽量防止 pH 值超越7.0。由于青霉素在碱性条件下不稳定,容易加速其水解。 溶氧:对于好氧的青霉素发酵来说,溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要要素。当溶氧浓度降到30%饱和度以下时,青霉素产率急剧下降,低于10%饱和度时,那么呵斥不可逆的损害。溶氧浓度过高,阐明菌丝生长不良或加糖率过低,呵斥呼吸强度下降,同样影响消费才干

14、的发扬。 在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。 在整个发酵过程中，需不断通无菌空气和搅拌，以维持一定罐压或溶氧。33.5. 菌丝形状：菌丝浓度：发酵过程中必需控制菌丝浓度不超越临界菌体浓度, 从而使氧传送速率与氧耗费速率在某一溶氧程度上到达平衡。菌丝生长速度：在葡萄糖限制生长的条件下，当比生长速率低于0.015h-1时，比消费速率与比生长速率成正比。因此, 要在发酵过程中到达并维持最大比消费速率,必需使比生长速率不低0.015h-1。菌丝形状：青霉素产生菌分化主要呈丝状生长和结球生长两种形状。在丝状菌发酵中, 控制菌丝形状使其坚持适当的分支和长度, 并防止结球 , 是获得高产的关键要素

15、之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球坚持适当大小和松紧,并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发扬其消费才干的关键素之一。34.发酵工艺控制6.泡沫的控制 ： 在发酵过程中产生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂 “ 泡敌 来消泡。 该当控制其用量并要少量多次参与, 尤其在发酵前期不宜多用, 否那么会影响菌体的呼吸代谢 。 加消沫剂控制泡沫，必要时还参与酸、碱以调理发酵液的pH。35.染 菌 处 理 染菌是发酵工业长期以来不能彻底处理的问题，因此如何处理染菌问题就成了发酵工业的任务重点之一。要处理染菌问题首要问题就是要能检测出能否染菌。 染菌通常经过三个途径发现：无菌实

16、验，发酵液直接镜检，发酵液的生化分析。其中无菌实验是判别染菌的主要根据。 36.染 菌 的 处 理染菌在发酵过程的每个阶段都能够发生，下面就各个不同的阶段的染菌情况和处置方法一一阐明。 种子培育期染菌 发酵前期染菌 发酵中期染菌 发酵后期染菌 37.染 菌 的 处 理种子培育期染菌 种子培育主要是生长繁衍菌体。此时菌体浓度低，培育基营养丰富，因此容易染菌。种子培育期染菌，带进发酵罐中的危害极大，应严厉控制种子污染。当发现种子受污染后均应灭菌后弃去，并对种子罐、管道进展检查和彻底灭菌。 返 回38.染 菌 的 处 理发酵前期染菌 发酵前朗主要是菌体生长繁衍，代谢产物生成很少，染菌后杂菌容易繁衍，

17、与消费菌争夺营养成分和氧分，严重干扰消费菌的生长繁衍和产物的生成，因此要特别留意发酵前期的染菌。当发酵前期染菌时，由于营养成分耗费不多，能耗也不大，从经济性的角度思索应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种进展发酵。 返 回39.染 菌 的 处 理发酵中期染菌 发酵中期染菌将严重干扰消费菌的代谢，影响产物的生成。如产酸，产泡沫，使菌体自溶，使发酵液变臭等。发酵中期染菌，由于营养成分大量耗费，普通挽救处置困难，危害性大，发酵中期染菌应做到早发现，早处置，通常做法是“倒罐，即用一罐没有染菌的发酵液与染菌的发酵液混合，使有害菌浓度下降，消费菌浓度提高进而重新成为优势生长菌群。显然，倒罐必然呵斥物

18、料耗费和操作费用的添加。 返 回40.染 菌 的 处 理发酵后期染菌 发酵后期产物积累较多，效价曾经很高，营养物质接近耗尽，此时如染菌量不多，可继续进展发酵，如严重污染也可提早放罐，停顿发酵，这在经济上往往是合算的。41.下游操作过滤萃取脱色结晶42.发酵液预处置青霉菌素发酵后，放罐，加少量絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空转鼓过滤或板框过滤青霉菌丝较粗，过滤较容易 ，除掉菌丝体及部分蛋白，过滤收率普通在90%左右。青霉素易降解，发酵液及滤液应冷却至10 低温保管，备后续提取精制。通常发酵液中青霉素浓度很低，仅0.1%4.5%左右，而杂质浓度比青霉素的高几十倍甚至几千倍。发酵液中常见的杂质有：菌丝、未用完的培育基、易污染杂菌、产生菌的代谢产物等。43. 提 取溶媒萃取法 青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调理pH，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。 常用有机溶剂：醋酸丁酯或戊酯44. 提 取溶媒萃取法 萃取2-3次。从发酵液萃取到醋酸丁酯时，pH选择1.8-2.0，从醋酸丁酯反萃到水相时，pH选择6.8-7.4。 发酵滤液与醋酸丁酯体积比3-4。 萃取总收率在8