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文档简介

1、PCR产物回收、酶切鉴定1.1实验目的掌握PCR产物回收和酶切鉴定的基本原理熟悉PCR产物回收和酶切鉴定的具体操作过程3.鉴定B-珠蛋白基因(卩-Gbobingene)多态性1.2实验原理PCR产物回收实验原理PCR产物一般都含有过量的引物、TaqDNA酶及dNTP,这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，回收试剂盒的出现使DNA的纯化过程变得更加简便、快捷。试剂盒PCR回收原理：试剂盒中回收管内所带的硅基质膜，具有在高盐、低pH值情况下吸附DNA，低盐、高pH值情况下释放DNA的性质。酶切实验原理限制性内切酶：生物体内能识别

2、并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。卩-珠蛋白基因PCR产物中含有Avail酶切位点，会被Avail酶切割。1.3方法步骤PCR产物纯化操作步驟将PCR反应产物移至干净的1.5ml离心管。加入3倍体积的BindingSolution至反应产物溶液(50卩1的PCR溶液，加入150卩1的BindingSolution并振荡混合均匀)将Spincolumn放入Collectiontube中，将反应溶液放入spincolumn中，以12,000Xg离心1分钟，丢弃collectiontube中的液体。加入700卩1的WashSolution，于12,000Xg离心1分钟。丢弃废液，重复此步驟

3、一次。丢弃废液，12,000Xg离心去除残余的酒精。将spincolumn转移至新的1.5ml离心管(microcentrifugetube)并加入30卩1的ElutionSolution或H2O(pH7.08.5)至column,静置2分钟。12,000Xg离心2分钟。Avail酶切反应操作步骤分别将20y1DNA、1MAVAII、5y110Xbuffer、24g1H2O加入1.5ml离心管中混匀，37C反应30min1.4结果i20Dbp1200bp34100bo45QObpSOODbp20眄11116bpiao4bp十lllEhji!=*1004hp*T90bp1.5讨论分析除了214b

4、p/790bp/1004bp/1116bp条带外，其他为杂带。由于片段太小，214bp条带无法显示，只有第10组可以看到。但由于第2、10、18、23、24组的790bp、1004bp和1116bp的条带可以识别，故认为这些组别的酶切位点表型为0Gg1/2（B1/B2）。部分组别（6、9、11、12、13、14、15、CM、JW、HP）条带微弱甚至无法识别的原因可能有以下几种：DNA的上样量不够DNA降解DNA走出凝胶对于EB染色的DNA，所用光源不合适上述问题对应解决办法是：增加DNA的上样量，琼脂糖电泳灵敏度比聚丙烯酰胺凝胶电泳稍低，上样量可适当增加。避免DNA的核酸酶污染缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度应用短波长（254nm）的紫

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