DNA的细胞化学Feulgen反应

1、【实验目的】了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。【实验原理】DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构成。DNA经1N盐酸水解，其上的嘌吟碱和脱氧核糖之间的双键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feu

2、lgen反应的专一性。O00_dna片段图4-1Feuigen反应红紫色化合物【实验仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。（二）材料洋葱鳞茎或根尖（三）试剂11N盐酸的配制取82.5ml比重1.19的浓盐酸加蒸馏水至1000ml。2.Schiff试剂的配制及保存称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然后冷却至50C时用滤纸过滤，滤液中加入10ml1NHCl，冷却至25C时，加入0.5gNa2S2O5（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡后，塞紧瓶塞

3、，在室温暗处静置至少24小时（有时需23天），使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于4C冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。3亚硫酸水取200ml自来水，加10ml10%偏重亚硫酸钠（或偏重亚硫酸钾）水溶液和10ml1NHCl三者于使用前混匀。【方法与步骤】1-将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1NHC1中，加热到60C水解810min。2蒸馏水水洗。3-Schiff试剂遮光染色30min。4用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1mi

4、n。5-水洗5min。6将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。7.显微镜检查。结果：细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。对照片：方法一先将材料放在5%三氯醋酸中90C水浴15min,主要把DNA抽提掉，然后按步骤17制片观察。方法二材料不经1NHCl水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤47制片观察。【作业】1、简述Feulgen反应的原理和实验的关键步骤。2、绘图示洋葱根尖细胞或鳞茎表皮细胞DNA的分布部位。实验23细胞电泳【实验目的】了解细胞电泳的意义和原理，掌握红细胞的电泳速度测定方法【实验原理】在外界附加电场作用下产生多相系统相

5、位移效应，称为电动现象，属于此种电动现象的包括电泳和电渗透。在电场作用下，液体介质中的悬浮质点与介质间的相对运动，称为电泳。将细胞制成悬浮溶液，使其单个游离的细胞分散于等渗的介质中，在电场作用下，细胞在电泳室内发生运动。这种现象称为细胞电泳。细胞表面具有一定的电荷（通常为负电荷），其表面吸附了一层极薄的水膜，它与介质间存在着电位差，此电位差称为Z电位。每种细胞在恒定的条件下（如温度、电压、电流、介质浓度、pH值等）其电泳速度和Z电位十分稳定，但在各种有害因子、病理状态的影响下，可降低其表面电荷，所以细胞电泳速度和Z电位值也发生改变（降低）。因此，利用细胞电泳研究生命结构的表面性质、鉴定细胞或单

6、细胞有机体的机能和病理状态具有重要的意义，这是一种十分有用的方法。【实验仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具LIANG-100型细胞电泳仪1台、光学显微镜1台、千分表1只、计算器1只、网格目微尺1个、台微尺1个、细胞电泳架1个、电泳毛细管1支、采血量管1支样品管1支、lml吸管1支、5m1注射器1支、50m1烧杯1个、解剖刀、剪刀、镊子各一把。（二）材料兔子或罗非鱼血（三）试剂氯化钠、蔗糖、肝素、琼脂。【方法与步骤】一、准备实验l细胞介质的制备根据实验要求，可选配以下各种介质：（1）生理盐水肝素液：在生理盐水中（0.9%NaC1液），按每m1加入45U（国际单位）的肝素，混匀后备用。（2）8蔗糖

7、肝素液：在8的蔗糖液中，加上述（1）含量的肝素，混匀后备用。（3）50血清液：用生理盐水将离心后提取的血清配成50%的介质。因血清中含有抗凝物质，在配制此液时不需再加入肝素。样品的制备根据实验对象（如红细胞、白细胞、血小板、巨噬细胞、癌细胞或植物的原生质体、叶绿体等），选择所需介质1ml,再用采血量管或微型移液管吸取浓缩细胞10mm3，加入上述介质中，并混匀。如做红细胞电泳，可直接用采血量管吸取全血10mm3,加入所选择的介质中混匀后即可使用。盐桥的制备称取9gNaC1加蒸馏水至100ml（即9%的NaCl液），溶解后再加入1.5克琼脂粉加热溶化，在加热时不断用玻璃棒搅动，直至全部溶化为止，此

8、时将已洗净凉干的塑料管插入溶液内，使管腔内全部被溶液充满，不得留有气栓。塑料管可切成1.31.4cm长，如无专用管，亦可用空圆珠笔芯代替，先用碱水煮沸，除去油污，再用清水洗净晾干，使用效果良好。网格目镜测微尺的校正在显微镜载物台上放置物镜测微尺（又名台微尺），转动显微镜镜筒的目镜并移动物镜测微尺，调整目镜测微尺网格的纵线与物镜测微尺刻度线平行并重合，将网格的一条细线与物镜测微尺的一条细线重合在一起。然后确定被一定数量的目镜测微尺网格刻度数所包含的物镜测微尺的刻度数，根据下式进行计算：naX=式中mX：网格的实际刻度值（mm或pm）；a：物镜测微尺的刻度值（通常为0.01mm）；n：物镜测微尺的

9、刻度数；m：网格刻度数。、，亠-7-.注意：（1）对网格目镜测微尺刻度值的校正，应选择在显微镜视野中部进行，因偏边缘具有相差，使测量不准确。（2）进行校正的放大倍数应足以保证能够进行实验观察，普通48pm的细胞可选择放大400450倍的物镜进行校正。毛细管电泳室静止层（即测量层）的计算毛细管电泳室是长6cm的管腔，呈正方形（有的为等边三角形）以玻璃制成毛细管，电泳室的制作工艺比较复杂，在其中相对应的内壁中线处，各刻有一条与内壁长轴一致的平分线，此线是在电泳测量时，观察一定深度的细胞移动的标准。根据流体力学原理，液体在管腔内流动，因为管壁对流体有吸附作用和摩擦力，其管腔内不同深度的质点的运动速度

10、是不一致的，管腔的中心处最快，紧贴管壁处最慢。在做电泳速度测量时，因为毛细管内不同深度点的运动速度差别极大，所以在其它因素（如温度、黏度、电压、电流强度、细胞浓度、pH值等）相对稳定的条件下，必须选择固定的深度进行测量，否则，因深度的变化而测定的电泳速度，将不能表示出正确的实验数据。但是，当电流通过电泳毛细管小室时，除了发生细胞和介质间的相对运动之外，同时发生介质连同介质中离子与毛细管壁的相对运动，这种现象称为电渗透。这时阴离子连同介质在管腔的中部向正极方向移动，阳离子连同介质在管腔的边缘向负极方向移动。因此，由于电渗的存在，所测得的数值是电泳和电渗的总和。电渗能够直接影响测定细胞的真实电泳速

11、率。因为在测量时电泳小室两端是封闭的，根据流体力学原理，室中液体的总流量等于零，由于毛细管腔中间的介质与边周介质间存在着向相反方向运动着的电渗现象，所以在彼此向相反方向运动着的介质的交界处其移动速度等于零，我们把这一层深度称为“静止层”或“测量深度”。在这一层进行细胞电泳测量，受电渗的影响最小，能够较准确地反映出电泳的速度。对于不同大小和形状的毛细管电泳室管腔的横截面其“静止层”深度是不一致的，国产的外方内方毛细管，内径为800lOOOpm,其静止层深度，经测定为内径深度的0.10.15处。在实际测量中，要不断的改变电流方向，测定往返运动着的不同细胞，如果电流方向不变，只测定向某方向移动的细胞

12、。则由于电渗的作用，使质点运动速度加快，以至造成“环流”，此时将不能进行电泳速率的测定。静止层（测量层）的测定：首先测出在划有刻度线的毛细管所对应二壁间的距离d（即毛细管内径）。在靠近观察壁划线的0.1d0.15d深度处，即为静止层或测量层。其测量方法有两种：一种是用显微镜的低倍物镜（X10）,先把细调焦旋扭的指示箭头对准刻度盘的“O”处，然后慢慢调整粗调焦旋钮把焦面对准靠观察面一侧壁的划线处，这时再旋转细调，使焦面逐渐向管腔内部延伸，直到调到对面壁划线的焦面时（视划线清楚为止），记下细调旋转的圈数和最后不满一整圈的刻度数，则可算出从第一条划线焦面至第二条划线焦面间物镜镜头前伸的距离，即为电泳

13、毛细管管腔的直径d。再用微调调焦旋钮（即与上反方向）使焦平面落在读数值为0.1d0.15d处即为测量层的位置。另一种方法是用千分表进行测量。此法较第一种测量数据更为准确。（1）用低倍物镜和粗调焦旋钮寻找电泳毛细管的前内壁黑线。（2）把千分表的前端与显微镜的移动台接触后，调千分表的指针至零。（3）利用微调焦旋钮找到后内壁黑线，读下千分表指针的读数，该读数就是毛细管的内径（如显示值为600，则这支毛细管的内径就是600pm）。（4）用微调调焦旋钮（即与上反方向）使焦平面落在读下千分表数值的0.10.15比例处，即为测量层的位置。6样品的灌注（1）用吸头与洗耳球连接装置盛上蒸馏水冲洗电泳毛细管（要小

14、心，以免损坏毛细管）。（2）将毛细管斜插入装有被测样品的小烧杯中，由于毛细作用，则整个管腔内充满了被测液体。（3）先在电极两端装上盐桥.然后把装好样品的毛细管平放在显微镜插板的测量槽中。装电极时，插板要一端倾斜一些，电极先从低端装入，然后把插板平稳地插入恒温装置内。（4）用鱼头夹连接电压电极（注意，切勿两夹碰撞或接触，以免损坏仪表）。（5）寻找测量层区域内的清晰的细胞进行测量。二、细胞电泳速度的测定的操作步骤连接电压输出引线和加热接口引线。2打开电源开头（在机的右侧），预置温度选25C（拨盘置于“250”，不能拨在“025”）。选择电泳电压40V,按A键D2显示电压（电压调节开关在机的左侧），

15、A键放开D2显示电泳室内的温度。4按D键测量红细胞电泳（10个有效红细胞按C键测量血小板电泳（100个有效血小板）按B键测量淋巴细胞电泳（100个有效细胞）5.按L和R上的移位键（MOVE），将不在网格线上的细胞移到线上。6按L和R下方的计时键（TIME），观察在线上清晰细胞向左移动2小格，再向右移动2小格。D1显示左计和右计的时间，两时间相等计时器自动接受，D2减去1,显示还要测9个细胞，如为无效就自动剔除。7.测满10个有效细胞后，D2回复到温度显示。D1的时间为总时间被自动封住，再按计时键也无反应。按D键后显示电泳时间，按C键显示电泳率。8重新测定按复位E或R键。三、电泳速度的计算根据所

16、测得目镜测微尺上网格的实际刻度值，实验测定的10个细胞共走了40个方格，为所测电泳距离的总和S，D1显示的时问为所测时间的总和t,电泳速度以下式表示：V=AS/tV为电泳速度，即细胞在总时间（t）内移动的距离（S）,S可用“m或mm表示。【注意事项】（1）电路接通后要迅速进行测量，以防时间拖长，细胞沉降。（2）用鱼头夹连接电压电极时，注意切勿两夹碰撞或接触，以免损坏仪器。（3）上机测量时，电泳毛细管两端应调至水平位置。（4）电极夹银电极盐桥毛细电泳室间都要接触紧密，盐桥及毛细管电泳室的腔内不得造成气栓，以免产生断路。（5）每次实验结束后，应清洗电极和毛细电泳室，干燥后放入小盒内。实验26环境因

17、素及辐射诱变染色体改组的观察【实验目的】学会鉴别外界条件诱变染色体改组的各种类型，为进行环境监测和诱变育种提供细胞学方面的依据。【实验原理】目前，由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排放等都存在污染环境的可能。欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，就需要一套高度灵敏，技术简单易行的系统来监测环境的变化。而生物监测技术是目前进行环境污染，化学诱变物质以及辐射对机体损伤程度监测的一个主要指标。同时，它也为进行辐射防护、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面提供了很好的手段。用于进行环境因素、诱变物质、辐射损伤的生物检测方法包括染色体畸变类型的

18、检测和微核的检测等。常用于测试的材料有鸭跖草、水葱花、韭菜花等的花穗，以及蚕豆根尖和小白鼠等。一般来说，处于分裂过程的细胞，对环境因素最敏感，尤其是处于减数分裂时期的花粉母细胞。诱变物质、环境污染及辐射对人类和其它高等生物的遗传损伤，在细胞水平表现为染色体畸变，遗传损伤不仅表现在体细胞，而且也通过生殖细胞扩散和积累。【实验仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具显微镜、解剖针、酒精灯、载玻片、盖玻片、吸水纸等（二）材料水葱花、韭菜花或紫露草花穗（三）试剂无水乙醇、冰醋酸、改良苯酚品红染色液【方法与步骤】（一）污水对花粉母细胞减数分裂期染色体的作用取材选取处于减数分裂期的花穗若干，剪下58cm的花序。

19、部分插在自来水中作对照，另一部分插在污水中，处理1224h，再移到自来水中恢复培养24h。固定用卡诺氏固定液固定12h，经95%、85%乙醇各30min,70%乙醇4C保存。制片剥取花药，用镊子轻轻捣碎，用改良苯酚品红染色510min，去掉残渣，盖上盖玻片。镜检用低倍镜找到分裂期细胞，再转用高倍镜，可看到经污水处理过的细胞中，染色体畸变的类型和微核的数目，分别要比对照组高。微核出现的多少，可作为监测环境污染程度的指标。（二）Y-射线对花粉母细胞减数分裂期染色体的作用1取材将未开放的水葱花、韭菜花或紫露草花穗（外面仍有膜状总苞包着）若干进行Y射线（剂量为0.258c/kg）辐照处理，处理后在水中

20、恢复培养12h,然后于上午911时把颖花剥下，用卡诺氏固定液固定12h，经95%、85%乙醇各30min,70%乙醇4C保存。2制片方法同前。3镜检观察染色体的各种畸变现象。（三）CO2激光对花粉母细胞减数分裂期染色体的作用取材取上述小花进行CO2激光处理，功能密度为20W/cm2,处理12秒后放在水中恢复培养12小时，然后用卡诺氏固定液固定12h，70%乙醇4C保存。制片方法同前。镜检观察染色体的各种畸变现象。【实验结果】经污水、辐照处理的材料，可见到下列畸变类型：染色体团聚：染色体胶连成团块，失去染色体的形态。在细胞分裂的前期、中期、后期、二分子期、四分子期及单核花粉期均可看到。落后染色体

21、：是由于分裂的细胞受到损伤（多半是由于纺锤体被破坏），而引起染色体不同步移动或者不移动造成的。多见于分裂中期和后期，这种现象有可能导致染色体数目的丢失。无着丝粒染色体断片：见于分裂前、中、后期，这种现象多会造成染色体上某个基因的缺失。染色体环：整组染色体胶连成一个大环或出现小环。染色体桥：在细胞分裂的后期或末期，同源染色体或姊妹染色单体分开时，部分有染色质丝粘连，使到分开不完全，从而造成染色体桥的出现。这种现象多造成染色体上某个基因的重复，有一至多桥。不均等分裂：细胞分裂结束时，产生的不是均等的四个子细胞（四分体）而可能是三分体、五分体、六分体、八分体等。微型小孢子：是由于多分体细胞的胼胝质壁

22、破裂后产生的体积比正常小孢子要小的一些孢子。微核：由落后染色体形成的核状小块。见于末期、二分子期、四分子期及小孢子期微核是游离于主核外，大小是主核的1/3以下，它的折光率和细胞化学反应性质和主核一样，已经证实微核率的大小是和污染程度、用药剂量或辐射累积效应呈正相关。所以微核计算已成为灵敏度高、技术简便的一种测试系统。它可用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变、新药试验研究以及环境污染程度监测的重要指标。【作业】绘图示各种染色体畸变现象并标明所处的分裂时期计算微核率。实验35植物组织培养技术实验目的】1了解和掌握植物组织培养的方法及其要点。2将胡萝卜贮藏根培养成为愈伤组织。3将菊花花瓣培养成为完整小植

23、株。【实验原理】植物组织培养的理论依据是植物细胞具有全能性，所谓细胞全能性是指植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息，在离体培养情况下，这些信息可以表达，产生出完整植株。要使细胞所具有的全能性表达出来，除了生长以外，还要经过脱分化和再分化等过程。分化了的植物根、茎、叶细胞，通过脱分化培养可以产生愈伤组织。愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团。愈伤组织经过进一步的分化培养，提供不同的营养和激素成分，又可再生出完整的小植株。植物组织培养技术，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中已显示了广泛的应用前景。实验仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具分析天平、超净工作台、

24、高压灭菌锅、培养箱或培养室、剪刀、镊子、手术刀、电炉烧杯、试剂瓶、培养瓶、酒精灯、精密pH试纸（二）材料胡萝卜块根、菊花花瓣（三）试剂配制培养基的各种化学试剂药品（见表8-1）,6-苄基氨基嘌吟（6-BA）、2,4-D、NAA、INNaOH、1NHC1、0.1%升汞、酒精、蔗糖、琼脂方法与步骤】（一）胡萝卜块根的脱分化培养1母液的配制在配制培养基时，为了使用方便，避免每次配制称量的麻烦，通常将各种成分配成比培养基需要量大10100X的母液（以MS为例，配制方法见下表）。表8-1MS培养基配方类型成分冷五冷主甘rH耐kr|JXL反注冷+宀配一升培养基的吸取量（ml）可丿1丄口介至丁工作浓度（mg

25、/L）HLmu液称取量（mg）与丫仪忤积（ml）1丿人1口就（X）大kno3190019000量nh4no3165016500元MgSO47H2O3703700100010100素KHPO241701700CaCl2HO224404400微MnSO4HO4222.32230ZnSO7HO428.6860量HBO336.2620KI0.8383100010010元NaMO”2HO2420.2525CuSO5HO420.0252.5素CoCi6HO220.0252.5铁Na-EDTA237.337.3100010010盐rm.FeSO7HO4227.827.8有甘氨酸2.0100机盐酸硫胺素0.4

26、20物盐酸吡哆素0.52550010010质烟酸0.525肌醇1005000配制母液时必须要注意，各种化学物质必须一一充分溶解后才能混合，以避免药物间出现化学反应产生沉淀。某些生长素，如2,4-D、IAA、NAA等，应先用少量95%乙醇溶解，最后才加水定溶。Kt、6-BA、2ip、ZT等细胞分裂素，应先用少量1NHC1或NaOH溶解，最后才加水定容。配好的母液要标记好配制日期以及药物的浓度。2培养基的配制把母液按编号顺序排列好，取大烧杯一个，先加入约300ml蒸馏水，按设计好的培养基分别吸取母液，最后定容到所需的量。调pH至5.8，每升培养基加入6.5g琼脂粉和30g蔗糖煮溶。分装到培养瓶中，

27、封好瓶口。基本培养基种类和附加成分是根据培养材料和目的来确定的。下列培养基及附加成分可作为组织培养实验中参考依据。MS培养基附加2,4-D2mg/L和6-BA0.2mg/L，适合胡萝卜块根愈伤组织的诱导；Miller或N6培养基附加2,4-D0.5mg/L,适合水稻花药愈伤组织诱导；而附加NAA0.5-2mg/L和3mg/L6-BA则适合水稻花药愈伤组织分化为单倍体植株。MS培养基附加NAA0.1mg/L和6-BA3mg/L适合菊花花瓣诱导分化。MS培养基附加NAA0.5mg/L适合多种花卉植物的根分化。3灭菌把分装好的培养基及接种用具放入高压消毒锅进行灭菌消毒。当压力升到0.5kg/cm2时，打开放气阀，放气5min后，再把放气阀关上，当压力升到1.1kg/cm2或0.11MP