CNS药物研发中的体内近红外荧光成像

1、Word文档 CNS药物研发中的体内近红外荧光成像 体内成像技术已成为中枢神经系统（CNS）疾病药物研发和临床评估的重要组成部分。650-950nm范围的近红外（NIR）荧光成像广泛用于临床前体内成像讨论，而向短波红外（SWIR，1000-1700nm）窗口具有更高的组织穿透性和辨别率，有很高的临床应用潜力。加南大讨论人员Maria J. Moreno等以SWIR窗口为重点，综述了近红外荧光光学成像模式的新进展。利用PHOTON公司的IR VIVO系列近红外二区小动物活体成像体统，具体讨论争论了开发新型有机和无机SWIR放射体的优势和挑战，特殊关注了毒理学和药理学方面。在成像仪器、算法和新的S

2、WIR放射体的进步的推动下，SWIR成像解决了临床前讨论CSN光学成像模式面临的主要障碍。生物相容性SWIR放射体的开发和多模式成像模式中SWIR的采纳有望将光学成像快速推动到转化讨论和临床应用中。文章以1-简介 慢性神经系统（CNS）疾病，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、多发性硬化、卒中和慢性痛苦等，正快速成为一种不断升级的流行病，对医疗保健系统都是一个巨大挑战。相较于其他治疗领域，CNS药物胜利率zuidi，很大一部分CNS靶向分子在早期/晚期临床试验中失败，只有6.8%的临床试验产品进入市场。CNS疾病药物开发面临的障碍与其他治疗领域类似：缺乏合适的疾病转化动物模型、临床前药

3、代动力学（PK）/药效学（PD）关系在剂量选择方面整合不足、缺乏对治疗反应的敏感早期检测，以及需要在临床试验中解决人群异质性的影响。此外大脑和神经精神疾病的简单性、血脑屏障（BBB）对药物和成像造影剂的高度限制、平安风险以及临床试验中缺乏可关心患者选择及早期疗效评估的生物标志物，使CNS治疗开发困难进一步加剧。成像方法的整合可关心解决一些问题。体内成像有助于确定合适的治疗目标，评估生物分布和药代动力学，评估靶点占有率、参加度和剂量反应，以及中靶和脱靶效应，还可能在临床前和临床药理学方面发挥肯定作用。从结构成像到分子成像，成像仪器和技术取得了重大进展，包括计算机断层扫描（CT）、正电子放射断层扫

4、描（PET）、单光子放射计算机断层扫描（SPECT）、磁共振成像（MRI）、超声波和光学成像。伴随着新分子靶标的鉴定、多功能造影剂的开发和提取定量数据的分析工具得以加速。PET、SPECT和MRI已被用于临床前疾病模型和药物开发评估，特殊是CNS领域，但对设施和培训要求高，在大多数学术甚至工业试验室中普及性不高。荧光光学成像功能强大、价格合理，是很好的临床前体内成像替代技术，而其辨别率也随着进展日益提高。此外荧光成像在临床应用也显示出巨大潜力，如荧光血管造影术、转移性淋巴结标测、心输出量评估、癌症定位、手术边缘评估和图像引导手术，弥补了光学成像技术传统上的感知问题。 本文将以短波红外（SWIR

5、）窗口为重点，综述近红外（NIR）荧光光学成像模式的新进展。回顾开发和设置仪器以及新型有机和无机SWIR放射体的优势和问题，特殊强调毒理学和药理学。争论临床前成像的将来前景及向神经成像领域临床转化的潜力。 2-荧光成像：从NIR到SWIR成像 荧光成像的原理是利用紫外光到红外光范围内的光激发分子，分子被激活会发出波长更长的光子，用特地的传感器能很简单检测到这些光子。但当光穿透组织层时，光-组织间的相互作用导致光发生汲取、反射、散射和自发荧光，这都会影响图像捕获和分析。近红外（NIR）（700nm-2021nm）光谱中的干扰要小于可见光（400nm-700nm）光谱，因此NIR区被认为是光学或治

6、疗窗口，此处光具有最大穿透深度，组织透亮度高。活组织中，光汲取使信号强度降低，主要是由于内源性发色团，如黑色素、水、脂质、氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白。这些分子的汲取峰在400-900nm，可通过NIR窗口（ 1000nm）成像来避开。组织自发荧光主要由NAD(P)H、胶原、弹性蛋白、色氨酸、酪氨酸、卟啉和FAD等分子产生，而这些分子放射大部分可见光波长的光。几乎全部生物组织的光散射程度都遵循反比波长关系（3-NIR-和SWIR成像探针 3.1小有机荧光团用于体内的商业NIR荧光探针大多是花青衍生物，通常表现出高摩尔消光系数，但荧光量子产率（QY）中等（约1-30%）。典型的例子是吲哚青绿（IC

7、G，Emission:800nm），目前广泛用于临床，包括眼底血管造影术、检测黑色素瘤患者的前哨淋巴结、乳腺癌、胃癌和血流监测等。水溶液中ICG分子形成J-聚集体并快速荧光降解。然而在血液中，ICG与血浆蛋白特殊是球蛋白紧密结合，并在血管中持续循环，成为动态血管和血流成像的优异染料。ICG通过肝胆管快速消退，并无代谢地释放到胆汁中，因此可用于观看肝脏和胆囊功能。ICG与蛋白质结合时会淬灭，最初认为这限制了分子成像应用，但随后发觉该效应可用于开发可激活探针，由荧光缄默染料（ICG）通过可酶切或对pH敏感的接头附着在蛋白质上。染料从蛋白质上解离后变得不行抑制，仅在目标组织中发光，与传统的持续放射探

8、针相比，背景荧光显著降低，灵敏度和图像对比度增加。ICG存在光稳定性差、水溶性差和QY低（血清中约9.3%）的缺点，因此需要开发新的有机NIR/SWIR荧光团，面临的挑战包括开发掌握荧光团放射波长所需的简单化学物质、将特别离散的波长转移到SWIR光谱，以及大多数新开发分子的QY都很低（0.01-1.4%）。新SWIR染料除改善物理化学特性（如高消光系数和量子产率、低光漂白和快速肾清除）外，还需要经过特别严格的毒性和平安性临床评估。FDA批准的ICG染料最初被认为限制在1000nm的NIR范围内，但用InGaAs相机分析时显示出一条扩展到1500nm以上的长放射尾。此外在对比度和图像辨别率方面，

9、较弱的SWIR非峰值发光优于明显较强的NIR-峰值发光。因此将InGaAs摄像机与当前的临床成像平台相结合，有望使SWIR成像向快速跟踪临床转化（图2）。 3.2有机/聚合物纳米粒子 聚集诱导放射发光体（AIEgens）是SWIR发光体的另一种形式，在生物医学成像中有很大潜力。与大多数聚集诱导猝灭的有机小分子荧光团相反，AIE荧光团在从孤立分子转变为聚集纳米粒子状态时表现出荧光增加。使用供体-受体（D-A）方法产生AIE点（BPN和TQ用作供体和受体单元）。TQ-BPN采纳两亲性聚合物Pluronic F-127封装成有机点，所得TQ-BPN量子点具有宽放射光谱（700-1200nm），激发/

10、放射峰在约630/810nm，强拖尾可至1200nm，在NIR和SWIR区的QY分别可达13.9%和2.8%。TQ-BPN点在水和血清中表现出良好的光稳定性，并且在连续635nm激光照耀1h后没有光漂白。此外，与用NIR-I硅基CCD相机成像的小鼠相比，用TQ-BPN点注射并用SWIR InGaAs照相机成像图像辨别率更高。全身成像显示有机点循环时间较长（ 12h），肝脏和脾脏是主要积聚器官，这很可能是由于F-127的长PEG链。结合显微血管造影术可显示800m深度的小毛细血管（直径约18.4m）、提取血液动力学参数（如平均血流速度和血流量），以及监测小鼠大脑中的光血栓性缺血（PTI）和血脑屏

11、障（BBB）损伤。有讨论设计了聚合物点（polymer dots, Pdots），其中phenothiazine、benzothiazole及其衍生物（benzothiazole, BT、naphtho2,3-c1,2,5 thiadiazole, NT和benzobisthiadiazole, BBTD）分别用作供体和受体，给予聚合物在1300-1400nm内的高位移荧光波长。所得Pdots在水溶液中显示约1.7%的荧光QY，比四氢呋喃（THF）溶液中的原始聚合物高约21倍。使用1319nm长通滤波器透过颅骨对血管内Pdots成像，与使用1250nm长通滤波器相比，显示出穿透深度和信号背景比

12、显著改善，证明在1300nm光学区域中大脑具有优异透亮度及图像辨别率。 3.3量子点（Quantum dots, QDs） 量子点是直径约2-20nm的小型半导体纳米粒子，由元素周期表第-族、第-族和第-族元素构成的核壳结构组成。这些粒子具有高荧光QY（约2080%）、高光稳定性和通过粒子尺寸操作的可调放射波长（从可见光到SWIR），较大的粒子以较长的波长放射，因此在成像应用中表现优异。量子点一般放射相同的光，与使用的激发波长无关，并且放射光谱特别窄，使得仅用一个光激发源就能同时记录由量子点混合物发出的不同颜色，这一特性正被用于生物分子（如蛋白质、肽或DNA）的多重光学编码，并在高通量药物筛选

13、、基因表达分析和临床诊断方面具有巨大潜力。量子点通常在有机溶剂中产生，因此不溶于水。水溶性可通过封装在二氧化硅或两亲共聚物中，或通过用水溶性配体包覆来实现。尽管成像特性优秀，但其固有毒性是生物应用中的主要关注点。降低毒性的方法包括用ZnS壳表面钝化或用有机分子/聚合物（如PEG）涂层。然而量子点尺寸较大，超过了肾脏清除的流体动力学半径截止值（约5.5nm），可在肾脏、肝脏和脾脏中长时间积累，毒性核心物质存在泄漏风险。另外量子点还可转变细胞中的基因表达，会在分子水平上产生意想不到的长期影响。因此生产更稳定的涂层以爱护量子点免受外部环境影响，并防止潜在害毒性、开发具有所需光学性能且无毒的新材料，仍

14、旧是该领域主要关注的问题。 3.4单壁碳纳米管（single-wall carbon nanotubes, SWCNTs） 单壁碳纳米管是一种新型纳米材料，以其独特的机械、光学、热学和电学性质引起极大关注。碳纳米管是圆柱形石墨空心管，由一个蜂窝状网格中的碳原子组成，直径很小，通常在0.5-2nm间，长度从50nm-1mm不等。单壁碳纳米管的很多性质取决于结构，其特征在于手性指数（n,m），该指数定义了六边形碳晶格中圆周矢量的长度和方向。单壁碳纳米管可以是半导电的，也可以是金属的，取决于它们的手性角度和直径，单壁碳纳米管制剂通常包含两种类型的混合物。半导体单壁碳纳米管在SWIR显示出剧烈的光学荧

15、光，在体内成像方面有巨大潜力。但仍需解决其相关的毒性问题（疏水性及易在水中聚集形成束），改善溶解性和生物相容性。解决方法包括用大分子如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚苯乙烯磺酸盐（PSS）包裹，以及用聚（环氧乙烷）PEO或氨基葡萄糖官能化。另外潜在毒性方面的报道相互冲突，部分缘由是不同试验室的单壁碳纳米管制备、纯化和增溶方法缺乏标准化。细胞毒性主要取决于尺寸和表面功能化，与共价修饰的长碳纳米管相比，非共价功能化的短碳纳米管毒性较低。最重要的问题包括长期吸入后的肺毒性、中度皮肤刺激和炎症。就其药代动力学而言，分散在水中的单壁碳纳米管尽管分子量较大，但可通过肾小球过滤快速清除，血液循环半衰期为几个小时

16、，这也显著降低了在身体器官中长期积累的风险和潜在相关毒性。尽管如此，单壁碳纳米管仍需进一步的生物相容性和毒性评估，以确定其在临床中的可用性。 4用于中枢神经系统成像的NIR/SWIR成像 4.1脑血管成像 脑血管解剖及生理学与神经元功能和脑病理学亲密相关。神经血管耦合是功能性磁共振成像的基础。此外，由脑血管和毛细血管形成的血脑屏障（BBB）是一种动态的物理和分子屏障，掌握着外围和大脑之间的物质和信息交换。无创成像的首要挑战是辨别率和穿透深度。MRI和X-光CT是两种常规脑部临床成像方式，MRI可敏感地检测软组织病变，X-光CT可供应大脑的解剖横截面图像。在检测大脑形态变化方面二者的深度穿透力优

17、秀，但对小血管辨别率不足。基于可见光和NIR-I荧光的成像技术尽管辨别率很高，但活体内脑成像时组织穿透性差、光散射较高，且成像脑脉管系统常需要颅窗，应用上也很受限。随着SWIR成像系统的进展，利用各种荧光放射体如有机染料（图3）、单壁碳纳米管和量子点，实现了透过完整的小鼠颅骨观看到直径小于10m的脑微血管。使用(SWCNT)-IRDye800共轭物结合800-1700nm放射光，对SWIR区域进一步探究发觉了两个光学子窗口，即NIR-a（1.3-1.4m）和NIR-b（1.5-1.7m），成像指标（包括透亮度、辨别率和穿透深度）均有所改善。这是由于头皮、颅骨和脑组织在这些光学区域的散射系数降低

18、，以及NIR-b窗口中水汲取显著降低。通过使用InGaAs摄像机以高成像速率（5.6fps）在NIR-a光谱中成像，可以高时间辨别率记录血液-大脑灌注，并实现对完整小鼠大脑中血流淌力学的实时评估。此外通过将主成分分析（PCA）应用于时间进程图像，基于血液动力学差异可区分动脉和静脉。 图3 SWIR IMA IR显微镜（Photon etc, QC, Canada）的光路和主要部件示意。（b）使用IMA IR显微镜通过静脉注射ICG的小鼠的完整颅骨成像的脑脉管系统显微照片（Ex:808nm，Em:1250nm）。4.2脑血管病理成像 除脑部脉管系统的解剖可视化和定量血流图分析之外，NIR成像还可

19、评估脑肿瘤或脑血管损伤后的血管病理和血脑屏障破坏。如使用NIR-I探针非侵入性时域光学成像，可将光学示踪剂浓度与其组织深度耦合，测量探针荧光寿命，即探针在返回基态之前处于激发态的时间，与探针浓度无关，但受局部组织环境（包括pH、缺氧或缺血）影响。如评估卒中小鼠模型静脉注射的不同大小示踪剂（Cy5.5 vs Cy5.5-albumine）的生物分布、荧光浓度和荧光寿命、评估缺血期间和之后时空上血脑屏障的渗透性变化，以及检测具有潜在代谢扰动或水肿的区域的四周（半暗带）。 CNS疾病试验模型中SWIR成像已被用于透过完整的小鼠大脑检测血液循环特别。如在手术诱导的大脑中动脉闭塞（MCAO）卒中模型中，

20、SWCNT作荧光示踪剂，检测到与对侧相比，受MCAO影响的半球血液灌注显著削减（80%）。此外在脓毒症小鼠脑静脉血栓形成模型中，使用PBs QD100（Em:1100nm；QY = 8%）示踪剂，量化了施用脂多糖（LPS）使血栓数量削减；通过施用肝素使血栓形成/数量削减。这些结果证明白NIR荧光成像在评价脑血管病理状态中的价值。病理学成像也可用光学成像技术实现，脑肿瘤表现出特别的脉管系统，这些特别表型伴随着基因/蛋白质表达谱的转变、独特的血管生物标志物的存在。靶向部分如单克隆抗体（mAbs）、单结构域抗体（sdAbs）和肽与不同造影剂（包括NIR荧光示踪剂）结合，可观看体内肿瘤选择性抗原的表达

21、和分布。胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）是胶质母细胞瘤血管生物标志物中表达zuifengfu的之一，由肿瘤内皮细胞产生并分泌到基底膜中，与胶原蛋白和层粘连蛋白等细胞外基质蛋白相互作用。IGFBP7参加肿瘤血管的血管生成和周细胞募集，其表达与高级别胶质瘤和不良预后相关。由抗IGFBP7 sdAb连接到肿瘤血管成像造影剂组成的靶向分子成像探针，可有助于脑肿瘤诊断和临床管理，包括高级别胶质瘤的识别。靶向IGFBP7的sdAb，用NIR-I Cy5.5荧光团标记，能够在小鼠胶质母细胞瘤原位模型中对肿瘤脉管系统和未受影响的脑区进行分子鉴定和密度评估。基于上述发觉开发出的靶向双峰光学MRI造影剂

22、，抗IGFBP7 sdAbs和Cy5.5被生物结合到钆涂层脂质颗粒的表面，在异种移植胶质母细胞瘤中，与非靶向纳米粒子相比，MRI成像对比度增加和荧光信号显著增加，突出了多模式成像探针的潜在临床用途。花青染料具有高亲脂性，未结合的Cy5.5或Cy7染料可与肿瘤非特异性结合。因此，开发了新一代NIR-型染料，其理化性质更优秀，包括水溶性、分散性和约800 nm波段的红移峰。如IRDye 800CW（Ex/Em: 774/ 805 nm）比Cy5.5具有更深的组织穿透性和更高的信号-背景比。IRDye 800CW与RGD序列（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）结合，识别整联蛋白，即在肿瘤血管系统和肿瘤细胞中

23、高度表达的细胞表面受体，胜利地鉴定了同基因和异种原位胶质母细胞瘤肿瘤中的肿瘤和肿瘤边缘。目前，有14项临床试验使用NIR-荧光造影剂（ICG和IRDye800CW）对脑部病变进行成像（Table 1）。 4.3脑部病变成像 血脑屏障的存在限制了大多数成像剂的脑部输送。血脑屏障由特别的无穿孔内皮细胞组成，这些细胞具有外排转运蛋白，可防止不需要的血液成分进入CNS。虽然在维持大脑稳态方面发挥着特别重要的爱护作用，但它也是靶向成像探针穿透深部脑组织的主要障碍。为此，利用位于大脑内皮细胞腔表面的受体/转运体关心成像剂进入，这些受体/转运体在配体结合时，通过简单的囊泡分选途径内化并到达腔外，这一过程被称

24、为受体介导的胞吐（RMT），已被用来开发靶向部分（肽、单克隆抗体和sdAbs）。RMT受体包括转铁蛋白受体（TfR）、胰岛素受体（IR）、低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（LRP-1）和TMEM30A。其他替代方法包括聚焦超声在选择性大脑区域产生临时性和可逆的BBB机械开口，或使用巨噬细胞仿生支架增加血脑屏障和肿瘤的穿透。在某些状况下NIR荧光探针可以自然穿过血脑屏障，或者进行化学修饰以增加穿透性。 4.3.1神经退行性疾病 神经退行性疾病包括一系列以大脑神经元结构或功能渐渐丢失为特征的疾病，它的一个标志是大脑中聚集了错误折叠的蛋白质，具有强大的神经毒性作用，如淀粉样蛋白（A）和Tau蛋白的积累与

25、AD有关，-突触核蛋白（Syn）的不溶性纤维与PD有关，亨廷顿蛋白（Ht）蛋白的聚集诱导亨廷顿氏病。作为这些疾病的罪魁祸首，错误折叠的蛋白质已经成为诊断成像和治疗干预的主要目标。已经开发了各种选择性结合A的NIR探针以成像A的积累。NIAD-4是第一批用于体内对A斑块成像的NIR探针之一。当结合到聚集的A蛋白上时，该染料显示出红移（汲取超过600nm）和荧光强度的剧烈增加（400倍）。虽然静脉注射后能够穿过血脑屏障并选择性结合A，但无创体内成像中发光不足。AOI-987是一种恶嗪染料，放射波长较长（Em: 670nm），高度亲脂性，能够穿过血脑屏障，是第一个允许在AD动物模型中观看体内A斑块的

26、NIR探针。姜黄素类似物CRANAD-2可将放射转到波长更长的NIR（805nm），并显示出对A聚集体的高亲和力和与A结合时荧光强度的显著增加。CRANAD-2能够穿过血脑屏障并在AD小鼠模型中检测到A斑块，但检测通过荧光反射进行，穿透深度和辨别率较低。通过化学改进，新荧光染料DANIRs（Em: 665 nm）实现了与A斑块和A原纤维的高亲和力结合，良好的血脑屏障透过性，以及在APPswe/ PSEN1双转基因小鼠中检测A的优异力量。通过用4.3.2脑肿瘤 在脑肿瘤中，胶质母细胞瘤是最恶性的，有高度血管生成和浸润特性，最常见于成人。其在分子水平的特征是存在多种途径突变和遗传转变。即使特别乐观

27、地治疗，包括肿瘤切除、放疗和化疗，胶质母细胞瘤患者的中位生存期仅约为18个月。zuichangyong于诊断胶质母细胞瘤的成像方式是MRI、CT和PET。肿瘤具有剧烈的增殖表型，因此需要高水平葡萄糖摄取。这导致肿瘤细胞质膜上葡萄糖转运蛋白（GLUTs）的上调，该特性已被用于成像，使用葡萄糖类似物18 FDG（2-fluoro-2-deoxyglucose）作踪剂来观看肿瘤活性的PET成像。在查找放射性脱氧葡萄糖（DG）的替代物时，一种与2-DG共轭的NIR染料IRDye800CW 2-DG（Ex: 785 nm，Em: 810nm）在异种移植原位模型中显示出优异的肿瘤靶向力量。CT和MRI聚焦于肿瘤大小和精确解剖定位，而代谢成像可供应肿瘤组织功能状态的独特信息，代谢NIR荧光剂看评估肿瘤生物学的特征，如缺氧、坏死和血管生成，并可作为临床前和临床讨论之间的转化平台。通过血脑屏障和血液肿瘤屏障（BTB）进入肿瘤方面的