五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒（PCR法）说明书

1、Word文档 五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒（PCR法）说明书 五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒（PCR法）说明书 u产品说明 五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒PCR法可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于致泻大肠埃希氏菌的检测。检出限为103CFU/ml。 产品组成（96测试） 所需仪器 ABI，BioRad，TaKaRa等PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪等电泳配套设备。（使用荧光定量PCR仪进行定性判读时则无需电泳设备） 自备耗材和仪器 灭菌1.5mL或2.0mL离心管；冰盒；移液器（0.5-10L，10

2、-100L，100-1000L）及配套灭菌吸头；离心机；涡旋混匀器；金属浴。 样品处理 参照GB4789.62021食品平安国家标准 食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验中的操作步骤进行前增菌。建议使用试剂配套细菌基因组DNA提取系列产品。 试验操作 1.试剂配制（试剂配制区，放置于冰盒中进行）取出各管试剂，将试剂完全解冻，离心30s。取12(所待检样品数+3)的PCR反应管，按12个一组排列并编号，依次向各管中加入23L的12种反应液。 2.添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）向每管反应液中分别加入2L模板（或直接使用无菌吸头挑取少许待检菌落至反应管中）。加样示例：（有N个待测样品） 取

3、(N+3)组12个一组的反应管，按挨次第一组12管中全部加入2L的NG-DW，其次组12管中全部加入2L的NG-Ecoli，第三组12管中全部加入2L的样品1模板，第四组12管中全部加入2L的样品2模板，最终组12管中全部加入2L的PG-Ecoli。 盖好PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，马上进行PCR扩增反应。 3.扩增反应（扩增及产物分析区） 按下列条件设置扩增反应：（如需使用荧光法进行检测请选择FAM通道） PCR循环 荧光收集位点 37 10分钟 1个循环 95 10分钟 1个循环 95 30秒 30个循环 63 30秒 72 90秒 72 5分钟 1个循环 4.产物电泳（扩

4、增及产物分析区） 称量4. 0g琼脂糖粉，加入至200 mL的1TAE电泳缓冲液中，充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾，直到琼脂糖粉完全溶化形成清亮透亮的溶液。待琼脂糖溶液冷却至60右时，加入溴化乙锭(EB)至终浓度为0.5g/mL， 充分混匀后，轻轻倒入已放置好梳子的模具中，凝胶长度要大于10cm，厚度宜为3mm5mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡，用一次性吸头当心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。当琼脂糖凝胶完全凝聚硬化后,轻轻拔出梳子，当心将胶块和胶床放入电泳槽中，样品孔放置在阴。向电泳槽中加入1TAE电泳缓冲液，液面高于胶面1mm2mm。将5L PCR产物与1L 6上样缓冲液混匀后，用微量移液器吸

5、取混合液垂直伸入液面下胶孔，当心上样于孔中；阳性对比的PCR反应产物加入到最终一个泳道;第一个泳道中加入2 L分子量Marker。接通电泳仪电源，依据公式：电压=电泳槽正负极间的距离（cm）5V/cm计算并设定电泳仪电压数值；启动电压开关，电泳开头以正负极铂金丝消失气泡为准。电泳30min45min后，切断电源。取出凝胶放入凝胶成像仪中观看结果，拍照并记录数据。 u可使用Gold view、Gal-Rad等等效的核酸荧光染料替代EB。 u推举使用DNA Marker：DL2021或100bp ladder，等可指示100bp1500bp条带的Marker。 结果分析 1.阴阳性判读： 进行电泳

6、检测时，需对比Marker进行推断，当目的靶标对应位置消失单一显著条带时可推断该靶标为阳性；否则为该靶标检测为阴性。（使用荧光定量PCR仪检测时，检测孔Ct30时推断该孔为阳性；当检测孔Ct30时，该检测孔为阴性） 示例电泳图2.有效性判读： 需同时满意：1.空白对比中全部泳道均为阴性；2.阴性对比中uidA泳道阳性，其余泳道阴性；2.阳性对比中全部泳道阳性，此时可推断试验有效。如无法满意上述条件，则试验无效，需重复试验；如重复后结果仍为无效，请于本公司技术支持联系。 3.结果判读： 在试验有效的状况下，可依据下表进行判读： 致泻大肠埃希氏菌类别 目标条带的种类组合 EIEC ipaH（） uidA （） EAEC aggR，astA，pic中一条或一条以上阳性 EPEC bfpB（），eae（），stx1（）stx2，（） STEC/EHEC stx1，stx2中一条或一条以上阳性，eae（），bfpB（） ETEC lt，stp，sth中一条或以上阳性 u97%以上大肠埃希氏菌为uidA阳性，可参考阴性对比中该基因检测结果推断扩增效果； u当结果判定为EPEC阳性时，若bfpB靶标为阳