徐晨明-NIPT实验室检测及质量控制 上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院

1、NIPT实验室检测及质量控制徐晨明上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院NIPT介绍检测技术流程检测质量控制质量控制指标传统产前筛查 一组生化、超声指标的组合评估，预测不良妊娠的风险（21三体、18三体、开放性神经管缺陷）孕周检测手段检出率假阳率超声，颈后透明带82-87%5%11-13+6周扫描 (NT scan)传统筛查方法 (Non-invasive)孕周检测手段检出率假阳率15 20血清学筛查(Quad screen)81%5%甲胎蛋白(AFP)绒毛膜促性腺激素(hCG)游离雌三醇 (uE3)抑制素A (Inhibin A)同时结合孕妇的预产期、体重、年龄和采血时的孕周综合评估计算风

2、险值无创产前基因检测 Non-invasive Prenatal Testing 1997, 胎儿游离DNA被发现 2003, 人类基因组计划完成 2005, 二代测序技术 (NGS) 突破针对外周血中游离DNA直接进行的无创产前基因筛查，近年来快速发展游离DNA发展史1947年外周血中发现游离DNA2011年NIPT1997年胎儿游离DNA的发现临床应用1987年恶性肿瘤患者血浆中分离出游离2007年NIPT方法学的建立DNA（cf-DNA）将提取到的血浆血清的DNA，用Y染色体特异性引物扩增，扩增后的产物凝胶电泳后观察条带。13、14号为男性基因组，阳性对照，15号为未怀孕女性基因组，16

3、号为阴性对照。可见怀孕的女性血浆里可以检测到男性胎儿的DNA胎儿游离DNA特点来源： 胎儿细胞通过胎盘渗透到母血中，被母体免疫系统破坏，胎儿DNA残留下来； 胎儿细胞凋亡； 胎盘滋养层细胞凋亡。基本特点： 含量有一定的变化规律。妊娠第5周开始可检测到胎儿游离DNA，随着孕周增加而增加，但存在个体差异； 分娩后短时间内消失，平均半衰期为16.3min，2h后无法检出； DNA片段较小，平均166bp左右。Am. J. Hum. Genet. 62:768775, 1998不同的人的胎儿的浓度有个体的差异，但总体是随孕周的增加而增加基于二代平台的NIPT技术TargetedSequencingMa

4、ssively ParallelShotgun SequencingTargetedSequencingNateraPanoramaSequenomMaterniT21TMIlluminaVerifiBerryBAMBNITMBGINIFTYTMAriosaHarmonyTMCOUNTINGSNPs 定量法通过全基因组测序或目标捕获测序来检测母血中目标染色体在基因组中的比例是升高或降低，通过统计学方法对胎儿染色体非整倍体进行评判 SNP法则通过分析母亲、父亲基因组和母血染色体中11000多个SNP位点的基因型和不同allele之间的比例，建立数学模型，并通过生物信息学方法计算概率，判断胎儿非整

5、倍体是否存在。部分文献报道的NIPT对21三体的产前检测论文阳性阴性Sensitivity SpecificityChiu et al (BMJ 2011)Sehnert et al (Clin Chem 2011)Ehrich et al (AJOG 2011)Palomaki et al (Genet Med 2011)Lau et al (JMFNM 2012)Bianchi et al (OG 2012)8613392121131434100%100%100%98.6%100%100%100%100%100%100%100%100%97.9%100%99.7%99.8%100%100%

6、100%100%99.9%100%99.9%100%410147176893650818404Sparks et al (AJOG)123Ashoor et al (AJOG 2012)Norton et al (AJOG 2012)Nicolaides et al (AJOG 2012)Dan et al (Prenat Diag 2012)Gil et al (UOG 2013)297288819391096297314311与传统产前筛查相比 cfDNA没有漏检T21，而传统方法漏检20% 降低了100倍的假阳性率 cfDNA在包括低危人群的整个人群中的检测效率同样好 T18和T13的假

7、阳性率（0.01%和0.02%）极低NIPS 可取代传统筛查成为一线筛查技术The following protocol options are currently considered appropriate: cfDNA screening as aprimary test offered to all pregnant women.There is now increasing evidence to show that the testing can also be applied to women withaverage risk.“可以将NIPT技术作为一线筛查提供给所有的孕妇。”

8、“越来越多的证据显示该项检测也可以提供给普通风险人群。”国际产前诊断学会（ISPD）2015年最新立场声明Benn P, Borrell A, Chiu R W K, et al. Position statement from the Chromosome Abnormality ScreeningCommittee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal DiagnosisJ. Prenataldiagnosis, 2015, 35(8): 725-734.检测技术流程样本信息采集数据分析样本接收上机

9、测序跟踪回访血浆分离DNA提取QC文库检测文库构建报告生成和发放血浆分离&DNA提取一步离心的缺陷全血4，1600g离心10min，取上清血浆 转速过低，游离DNA分离效率差血浆4，16000g离心10min，取上清血浆 过高的又会造成细胞破裂，母体DNA释放到血浆，增加背景，造成cffDNA的含量比例下降，影响检测目的是在需要测序的片段两端加上能够与测序仪配合的接头序列，以进行后续的测序文库构建 常规步骤：基因组DNA抽提-超声片段化DNA-DNA片段末端补平-； 游离DNA:直接通过末端修复获得两端平齐的DNA不同的测序平台加接头的方式会有差异 如果是illumian的测序仪测序，末端修复

10、后要通过在末端加个“A”碱基后再加接头（因为illumian的接头是末端是带一个突出的“T”碱基），proton测序仪测序，末端修复后直接加接头。 在加接头的过程中可以加入标签，也可在pcr的过程再加入标签（一段长68bp、序列已知的短链DNA）从而产生一个可用于区分不同样品的唯一编码，测序结束后，通过软件分析和筛选，即可从混合测序的结果中获得每个不同样品的测序结果。QC文库检测常用的检测仪 QPCR定量检测仪：对文库的浓度定量准确，如果测序仪对浓度的容忍度低建议使用此定量方法，但是不能检测片段长度。建议配合片段长度检测仪一起使用。 2100/2200生物分析仪：既可以检测文库的浓度又可以检测

11、文库的片段长度。但文库浓度定量没有QPCR定量准确。如果测序仪对浓度的容忍高建议使用此定量方法。2100检测仪7500荧光定量PCR仪 Qubit浓度检测仪：对文库的浓度定量，浓度误差大，成本较前两种低。如果是熟练稳定的建库同时测序仪对浓度的容忍度高的，可以使用此种方法结合毛细管电泳对文库进行质控。Qubit浓度检测仪Qsep100毛细管电泳QC文库检测 Hiseq 2000、Hiseq2500、Hiseq4000、Hiseq x10等对上机浓度容忍度低的测序仪建议要用QPCR定量仪定量 对于小RNA建库，外显子捕获测序，全基因组测序的文库建议要用2100/2200来确定建库后文库片段的大小

12、由于血浆游离DNA本来就是小片段的DNA，而且proton对上机的浓度的容忍度比较高，所以无创建库样本可以直接用qubit进行定量。检测质量控制分析前-加强信息化管理加强分析前质量控制，对样本信息流进行质控。申请检测的项目临床信息采集、符合技术规范指征、知情同意检测申请样本采集采集信息收集（日期、样本类型）、采血管、样本体积5mL样本运送及时间、信息复核、接收标准、拒收标准，不合格样本的记录，录入LIS系统、生成样本唯一编号标本接收检测申请适用人群不适用人群孕周40）。（四）通过体外受精胚胎移植方式受孕。（五）有染色体异常胎儿分娩史，但除外夫妇染色体异常的情形。（六）双胎及多胎妊娠。（七）医师

13、认为可能影响结果准确性的其他情形。注：本标准选自卫计委孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范样本运输及保存样本类型样本体积 运输条件备注4下条件暂存，必须离体8小时内 4条件下进行血浆分离。母体全血（EDTA管）5-10mL4 采血管或送检单上标记抽血日期及时间。全血离体72小时内 4 条件下进行血浆分离。母体全血（cell free DNA5-10 mL6-35 环境下采血管）常温运输血浆分离后短期（一周内）可以在20冰箱暂存，长期-80 条件保存；禁止将样本置于室温下放置，避免反复冻融。血浆2 mL干冰分析中-实验室质控与风险双审核质控审核融入实验过程，同时分析质控数据及其对样本风

14、险值的影响；进行室内质控室间评价，引入实时质控概念。每个标本有效数据量、唯一比对序列数目等文库构建上机测序血浆分离DNA提取文库质控信息分析三级质控设立空白对照防止混样及DNA污染设立空白对照、阴性对照、阳性对照，测量文库浓度DNA提取和文库构建的过程中可以加入阴阳性对照来监测实验过程的污染和最后的数据质量文库质控次峰过高建议检查血浆是否溶血，溶血的情况常常会出现次峰过高的的情况如有溶血建议重新采血，如无溶血建议重新建库引物和接头二聚体峰过高建议重新纯化文库，然后再检测看纯化结果，一般经过纯化可以去除引物污染上机测序质控测序完成后根据测序结果对测序做一个质控，合格的结果进行数据分析，不合格的结

15、果重新测序SBS测序法测序结果质控：半导体测序法测序结果质控：Template QC:Mean Read Length : 100bpSequencing QC:Total Reads：Key Signal：60M50PF（通过质控的cluster概率）80%Q30（质量值大于或等于错误率为0.1%以下的碱基所占比值）80%Key signal:模板平均信号强度，可以反映乳化pcr的效果分析后-加入数据分析质控信息分析DataUsable DataAnalysisResult数据测序质控数据In-Run质控数据分析质控数据分析过程中会对数据进行质控，合格的出报告，不合格的重新测序或者重新文库构

16、建测序质控质控指标Flow统计单位Run说明Flow标准260测序数Nomatch(M)Bases(G)meanLenQ20(%)Run0,4未能拆分到样品所剩下的比对序列条数样品原始比对序列碱基数SampleSampleSampleSample0.20,2100,12575,88.55,15样品比对序列的平均长度比对序列测序质量大于 的碱基占比20PCT(%)样品拆分比率数据In-Run质控质控指标UR_Mean(M)GC_Gap(%)统计单位说明标准3RunRunRunRunRunRunRunRun样品唯一比对序列条数的均值和 碱基含量波动范围G C0,2Fraction_Mean(%)D

17、up_Mean(%)Female_NumChr13_CV_RateChr18_CV_RateChr21_CV_Rate7,15样品的胎儿浓度的均值重复序列占总比均值女胎样品个数5Chr13_T_meanChr18_T_meanChr21_T_meanChr13_CV_RateChr18_CV_RateChr21_CV_RateChr13_RF_NumChr18_RF_NumChr21_RF_Num131821号染色体 值均值TRun号染色体 值均值TRun号染色体 值均值TSampleSampleSampleSampleSampleSample1318CVCV样品 号染色体相对 值范围样品 号

18、染色体相对 值范围21样品 号染色体相对 值范围CV样品 号染色体参考数13样品 号染色体参考数185样品 号染色体参考数215信息安全管理 所有操作在内网完成与外网电脑物理隔绝，杜绝信息泄露 系统权限设置清晰 患者信息和检测结果不离开内网系统闭环信息流：HIS-LIS-Halos/达瑞数据分析系统-LIS-HISHISLISHalos/达瑞数据分析系统报告发放报告应包含的内容（样本信息、采集唯一性标识、患者信息、检测信息、结果及解释等）确认检测结果与患者临床信息的一致性结果报告报告发放跟踪回访报告按时发放，高风险结果及时通知采集者生产后进行产后胎儿状况的跟踪回访，并做好记录对检测失败的样本，发放检测失败报告并注明原因报告发放 报告自采血至发放临床报告时间不超过15个工作日，其中发出因检测失败须重新采血通知的时间不超过10个工作日。 临床报告应当由副高以上职称并具备产前诊断资质的临床医师出具发放。 临床报告应当以开展相关技术的产前诊断机构名义出具，以书面报告形式告知受检者。 对高风险的产前咨询率应达到100%，产前诊断率应达到95%以上孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范质量控制指标21三体综合征检出率不低于95%，18三体综合征检出率不低于85%，13三体综合征检出率不低于70%检出率阳性预测值21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征的复合阳