引物探针设计原则

1、引物探针设计原则王争强Hotline: 400 620 9660cnmcbsupport定量PCR开发流程选择目标基因/ SNP位点设计探针和引物筛选引物、探针，优化各组分浓度验证完成 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.选择目的基因/SNP位点 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.序列查找 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.设计探针设计 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.两种

2、实验设计策略 正向策略 反向策略 修改反应条件 适应PCR引物 设计引物适应反应条件 确定标准的化学 确定标准的程序 设计标准的扩增产物 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.探针设计指南 先设计探针，后设计引物 探针的5端第一个碱基不能是G 基因表达探针Tm值：68-70C；基因分型探针Tm值：65-67C TaqMan-MGB探针长度在13-25bp，TaqMan探针长度13-30bp 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G C比G多的探针效果更好，如果C少于G，选择其互补链 多态位点应尽量位于探针中央，可以3个碱基 2009 A

3、pplied Biosystems. All Rights Reserved.为什么要C比G多？反义链：11 C / 3 G正义链：3 C / 11 G 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.基因多态位点探针中的位置DO NOTPLACE HEREpolymorphismNN N N N N N N N N N N N N N N N N NTry to position thepolymorphism here(central third)If necessary, put thepolymorphism here(region of MG

4、B) 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.用于基因表达的探针设计RQ3TaqMan探针Exon 1Exon 2Exon 3基因表达、cDNA定量研究中，特别设计探针跨过两个外显子，以增强扩增特异性 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.荧光标记基团的选择荧光染料最大发射峰(nm)用途6-FAMSYBR Green IJOE520520550550580580580610610670报告荧光报告荧光报告荧光VIC报告荧光TAMRANED淬灭荧光报告荧光CY-3报告荧光(7500)参比荧光RO

5、XTEXAS RedCY-5报告荧光(7500)报告荧光(7500) 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.探针设计指南 引物尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠 引物长度9-40bp，最优20bp，GC含量保持在30-80%之间 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G 引物Tm值在58-60C之间，上下游引物Tm不要超过2C 引物3端的倒数5个碱基中，G和C加起来不要超过2个 引物3端不要是碱基A，避免出现3个以上相同碱基 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对 避免引物自身形成环状发卡结构 扩增片段的长度在50-150

6、bp间 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.为什么要减少引物3端的G和C？5primer3polymerisationtemplate引物3端过多的G、C会导致暂时性错误复性，并很快就会被DNA酶稳定下来 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.Primer Express v3.0软件 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.引物探针设计常用工具设计软件：Primer Express、Beacon Desinger、Primer5网络免费资

7、源：/realtimedesign/MFold（http:/bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html） 引物和扩增产物二级结构的预测 二级结构的稳定性(delta G) 和融解温度(Tm)NCBI BLAST扩增特异性 /Blast.cgi 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.反应试剂优化成分反应浓度1050 mMTris-HCl（ pH 8.3 ）KCl引物 1引物 2探针 3dATP50100mM0.200.30 M0.200.30 M0.150.20 M0.150.20 mM0.150.20 mM0.150.20 mM0.150.20 mM0.030.05 U/l3.510 mMdGTPdCTPdUTPTaqMgCl2 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.引物浓度优化的数据判定N 高浓度/高效率 高浓度/低效率 低浓度/高效率N: 产物数量n: 循环数