09药品微生物控制的逻辑与策略-马仕洪

1、药品微生物检验控制的逻辑与策略马仕洪中国食品药品检定研究院2019年4月26日，苏州 基于过程控制理念的药品微生物实验室规划与发展 中国药典2020年版药品微生物标准体系增修订进展 灭菌工艺验证用生物指示剂的质量控制 风险 估在制药行业污染微生物过程控制中的应用 湿热灭菌 艺要点与参数放行进展药品微生物的过程控制 干热灭菌工艺验证用细菌内毒素标准品与细菌内毒素检测 药品无菌检查与隔离器的应用 制药环境分离微生物的鉴定技术应用 药品微生物检验控制 逻辑与策略一、关于无菌和无菌检查几点说明二、从终产品检验向过程控制转变三、无菌制剂中的微生物限度问题四、微生物监控与溯源调查的策略医药产品的发明与发展

2、进步极大地改变了人类的命运。一百多年来人们努力提高在“有菌的环境”生产“无菌的产品”的能力，事实证明这一努力至今充满挑战。典型的无菌生产工艺（来源于上海东富龙科技股份有限公司 发布时间：2011-09-28）2012年10月，美国新英格兰合成制药中心生产的注射用类固醇霉菌污染，造成数百人感染真菌脑炎，至年底统计死亡39人。在50支密封药瓶中检测出曲霉菌和突脐蠕孢菌两种类型。 无菌物品是指物品中不含任何活的微生物。对于任何一批 灭菌物品而言，绝对无菌既无法保证也无法用试验来证实。一批物品的无菌特性只能通过物品中微生物存活概率来表述，即非无菌概率（Probability of a Nonsteri

3、le Unit，简称 PNSU），这也被称为无菌保证水平（Sterility Assurance Level，简称SAL）。最终灭菌物品的非无菌概率不得高于10-6。已灭菌物品的非无菌概率可通过验证确定。中国药典2020版灭菌法（1421）讨论稿中国药典面临的概念难题！Ster eadjnSterilitySteriliz ion n生物去污？灭菌？Biodecontaminat表面灭菌！USP参考翻译Antiseptic An agent that inhibit or destroys microorganisms o livin tissueincluding skin ral cavi

4、ties, and open wounds.抗菌剂-在活组织表面，包括皮肤，口腔粘膜剂及开放伤口抑制或杀灭微生物制剂。Chemical DisinfectantA chemical agent used on inanimate surfaces and objects化学消毒剂-是指一种作用于无生命物体表面的化学制剂，目的是杀灭传染性的霉菌，病毒及细菌，但可能杀灭不了它们的（细菌和霉菌）孢子。杀孢子剂（Sporicidal）和抗病毒制剂可被考虑为是特殊一类消毒剂。to destroy infectioSporicidal and antgi, viruses, and bacteria, b

5、ut not necessarily their spores.gents may be considered a cial class of disinfectants.Cleaning AgentAn agent fo the removal om facility and equipment surfaces ofproduct residues that may inactivate sanitizing agents or harbor microorganisms清洁剂-一种能从设施和设备表面上移除产品残留的制剂，而这些残留可能会灭活除菌剂（Sanitizing Agent）或保护

6、微生物。DecontaminationThe removalicroorganisms by disinfectio or s rilization除菌- 通过消毒或灭菌移除微生物USP翻译Disinfectant-A chemical or ph sica gent that destroys or remov s vegetative forms of 消毒剂-是指当作用于表面时可破坏或去除有害微生物营养harmful mic rganisms when appl d to a surface.形式的化学或物理药剂。Sanitizing AgentAn a nt for reducing,

7、 on inanimate surfaces, t e number of allforms of microbial li e including fungi, viruses, and bacteria.除菌剂-是指一种作用于无生命物体表面的化学制剂，它能够减少所有形式活的微生物数量，包括霉菌，病毒和细菌。Sporicidal Agn agent that destroys bacter l and fungal spores when used in杀孢子剂- 一种特殊的消毒剂，在一定浓度条件下和特定时间内能够杀灭霉菌和细菌的孢子，它也被认为可以杀灭全部的繁殖体的微生物。sufficie

8、nt concentrat n for a specified contact time. It is e pected to kill all vegetativemicroorgani s.SterilantAn agent that destroys all forms o microbial life including fungi, viruses, and 灭菌剂- 能够杀灭所有形式微生物生命包括霉菌，病毒，all forms of bacteria and their spores. S rilants are liquid or vapor-phase agents.细菌以及它

9、们的孢子制剂。灭菌剂可以是液态或汽相制剂。根据Chp2020灭菌法等的最新修订和我国制药企业的实际情况确定合适的概念范畴。一、关于无菌和无菌检查几点说明中国药典1953年版即收载无菌检查法WHO 6号规程生物制品无菌规程由WHO 1960年发布，1973年修订中国生物制品规程1979年版开始规定硫乙培养基双份双温度分别培养，这一规定延续到2015年版无菌检查法，成为我国生物制品无菌检查的特殊规定美国FD （May 2001）和欧盟（March 1999）均接受药典无菌检查法适用于生物技术产品及生物制品（ICH Q6B，生物技术产品/生物制品检定规程及标准）差异原因内生物制品无菌检查在引用WHO

10、导则6出现的对FTM两种培养温度的规定；欧美ICH1994年接受USP/EP方法1101 无 检查法中生物制品的特殊规定我国是抗生素及注射剂生产使用大国，大量的产品验证报告表明检验条件下大肠更适合作为方法验证菌株1101 无菌检 法中以大肠为验证菌株1101 MCC菌株问题国际主要菌种保藏机构的利益冲突，当前维护中国大量中小型制药企业利益的必要性进一步强调培养观察体系的参照（No Control No Test）提供履行按验证/转移过方法系统检验的直接证据1101 阳性对照的规定1101 大体积抗生素 射液取样大于USP/EP鉴于我国当前大体积液体制剂的滥用和质量事故，加大检验力度必要，近10

11、年的方法验证研究可行标准的发展有一定的过程 规律，必须兼顾历史和现实，必须符合一国的工业实际需求。关于标准菌株的差异 大肠埃希菌(Escherichia coli)CMCC(B) 44102 枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis CMCC(B) 63501ATCC 6633 金黄色 萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26003ATCC 6538P 乙型副伤寒沙门菌Salmonella paratyphi B)CMCC(B) 50094 铜绿假单胞菌( seudomonas aeruginosa)CMCC(B) 10104 生孢梭菌(Clostri

12、di m sporogenes)CMCC(B) 64941 白色念珠菌 (Cand a albicans) CMCC(F) 98001 黑曲霉（ Asp rgillus nige ）CMCC(F) 98003ATCC10231Aspergillus brasiliensis Such a TCC 16404，IMI149007, IP 1431.83,or NBRC 9455 关于阳性对照的规定1、阳性对照是生物实验结果判断的基本要求。 NO CONTROL NO TEST！是 供方法经过充分验证和实验条件严格控制的实验室证据。2、2018年10月31日就这个问题专门与ICH交涉过，欧美并不是

13、不做阳性对照，他们认为是实验室基本要求，药典不用写。我们强调中国当前的现实需要药典提醒，他们表示理解。关于阳性对照的规定Lack of positive controlsYour firm did not use positive controls during microbiological testing to ensure the reliability of your testresults. Wa positive control is not used during testing, test results cannot be considered valid becauseth

14、e absence of microbial growth could be due to media l cking the appropriate nutrient composition,water content, purit or incubation conditions necessary to support growth of the microorganisms thatmay be present in the OTC drug product or component tested.应关注FDA警告 从数据完 性方面看待阳性对照的趋势。FDA调查人员对这些类型的观测将随

15、着时间的推移而增加。无菌检查的局限性 无菌是根据概率的原则判断的。从给定批号的所有产品中存在被污染产品的概率得出判断 无菌测试本身并不是设计用于保证产品无菌或产品已灭菌。产品的无 保证是通过灭菌工艺或无菌工艺验证来得到的。 无菌测试适用于药典要求无菌的药物或制剂。然而，合格结果仅说明在测试条件下受检的样品中未发现微生物污染 。无菌检查有什么意义？National Institutes for Food and Dr ControlHttp:/二、从终产品检验向过程控制转变特殊的医药环境使我国成为规模庞大的“吊瓶大国”！时间事件结果2006年5月“齐二药”亮菌甲素及其全线产 调错误使用二甘醇替代

16、丙三醇，与微生物污染无关查2006年7月2007年1月“欣弗事件”微生物污染“克林霉素磷酸酯注射液”和“阿奇克林107批7批无菌不合格；阿奇 90批3批无菌不格。取缔霉素注射液” 扩大调查两个品种的热力灭菌大体积液体制剂生产。2007年4月注射用甲氨喋呤企业清场不彻底，非微生物污染2008年10 月“刺五加”及在线产品调查云南事件是流通中微生物污染问题；后期扩展调查，企业微生物控制存在严重缺陷2008年11 月2009年“茵 黄事件”怀疑与微生物污染无关，经调查排除“双黄连注射液”全面开展微生物污染控制调查，多家企业停产整顿为什么没有提前发现问题？微生物检验能力建设“终产品检验”向“过程控制”

17、转变我们的药品为什么会这样？药品微生物污染事件的反思从某种意义上看，正是这些悲剧促使药典标准和GMP规定的进步。当前， 些标准的进步直接推动了我国药品微生物监管的转型，也将促使微生物检验工作发生更本性的转变，从而迎来发展机遇。监管前移：终产品检查过程控制National Institutes for Food and Dr ControlHttp:/The International Council for Harmonisation of Technical Requirements forPharmaceuticals for Human Use (ICH)中国药典2015版微生物标准体系

18、1101 无菌检查法1105 非无菌产品微生物限度检查法：微生物计数法11 非无菌产品微生物限度检查法：控制菌检查法1107 非无菌产品微生物限度标准1121 菌效力检查法1421 灭菌法9201 药品微生物检验替代方法验证指导原则9202 非无菌药品微生物限度检查指导原则9203 药品微生物实验室质量管理指导原则9204 微生物鉴定指导原则9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则9206 无菌检查用隔离系 验证指导原则中国药典2020年版规划USP40部分章节中国药典2020年版Antimicrobial Effectiveness Testing抑菌效力检查法Biological

19、Indicators-Resist nce Performance Tests生物指示剂抗性检查法Microbiological Examination of Nonsterile Products: Micr ial Enumeration TestsMicrobi gical Examination of Nonsterile Products: Tests f Specified Microorganisms非无菌产品微生物检查：微生物计数法非无菌产品微生物检查：控制菌检查法Microbiolog cal Attributes of Nonsterile Pharmaceutical P

20、roductMycoplasm非无菌药品微生物限度标准支原体检查法Sterility Tests无菌检查法Ap ation of Water Aity Determination to Nonsterile Pharmaceutical Products水活度检查法用于非无菌药品微生物评价Microbial Characterization, Identification, and Strain Typing药品微生物鉴定指导原则Microbiological Evalutionn Rooms and Other Controlled Environments药品洁净实验室微生物监测和控制指导

21、药品微生物实验室质量管理指导原则则Microbiological Best Labora y PracticesSterility Testing-Vali ion of Isolatorems无菌检查用隔离器系统验证指导原则灭菌法（重大修订）Sterilization and Sterility Assurance of Compendial A ticlesValidation of Alternative Microbiological M/药品微生物检验替代方法验证指导原则非无菌药品微生物限度检测指导原则中药饮片微生物限度检查法/JP17 5.02 Microbial Limit Te

22、st for Crude Drs 细菌内毒素（Endotoxin），是G-菌细胞壁层上的结构，主要成分为脂多糖（lipopolysaccharide, LPS） 由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)三部分组成。细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。 热原（ rogen），指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是G-杆菌的产物， 次是G+杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母、甚至病毒也能产 热原。微生物过程控制“中国式溯源调查”！ChPUSPEP

23、JP化药终端灭菌无菌制剂参数放行【性状】【鉴 】【检查】 无菌/微生物限度【含量测定】化药非无菌制剂微生物参数放行符合性标准风 评估2019年3月28日CDE发布的化学仿制药参比制剂目录（第二十一批）-注射剂药品微生物过程控制的内在需求：-注射剂一致性评价-中药 o60辐照滥用问题-C R-T等创新药的无菌快速释放生化制剂无菌保障评价标准研究注射剂一致性评价微生物控制与溯源调查评价研究消毒剂效能验证指导原 的建立研究注射剂的微生物过程控制的分解头：饮片、辅料、包材过程：设备、人员、环境工艺：物理参数验证与微生物学验证监控、OOS、微生物限度问题！如何认识微生物限度标准的本质和意义？通 特定的方

24、法（培养观察）分别从质（特定微生物种群与类别）和量（微生物数量或荷载）界定微生物的风险。原料药的霉菌数内控标准为200cfu/g,测结果为100cfu/g,制备成3.3mg/mL，霉菌内控标准为10cfu/100mL，预过滤前后 菌的生物荷载检测结果：样品取样（3 3mg/mL）预过滤前-23ml检测结果2 CFU/10mL1CFU/10mL预过滤后-23ml这个案例中有哪些问题？如何建立一个合适的微生物限度标准？（微生物限度标准=方法+限值）足于相应微生物风险控制目标需求；法规文献支持；历史数据统计分析；风险分析、效 和成本平衡如1mg/unit10g=10000unit芽孢、生物膜药品微生

25、物检验的特殊性休眠体亚致死受伤死亡活跃3939酒精棉球分生物新洁尔灭分离微生物 全过程管控微生物风险，在安全性方面首先排除已知的、公认的微生物因素。 微生物不会说谎，要重视从微生物角度展示的质量问题。无菌药品：药品GMP指南P317企业应尽量开展微生物鉴别的相关工作。对检出的微生物进行鉴别，能为环境监测计划提供至关重要的信息。在失败的培养基灌封或无菌检查中，分离到的污染菌，通常会与环境监控中的分离菌密切相关，由此建立的微生物数据库能为调查提供有价值的信息。National Institute of Food and Drug ntrolHttp:/USP37 MICROBIAL CHARACT

26、ERIZATION, IDENTIFICATION, AND STRAIN TYPINGMicroorganisms, if de cted in drug substances, excipients, water for pharmaceutical use, the manufacturingenvironment, intermediates, and finished drug pr ducts, typically undergo characte ization. This may includeidenti ation and strain typing, as appropr

27、iate.如果在药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中发现微生物，典型的做法是做鉴别，包括鉴定和菌株。In some ca s a more definitive identific tion of the microorgan sms yields genus- and species-l vel identification.Bey d this, availa methodologies an perform strain-level iden fication, which can be useful in an investigation todetermine the

28、 source of the micr organism.在某些时候，微生物鉴 需要达到更加明确的水平，如种属水平的鉴定。除此以外，菌株水平的鉴定在污染调查的过程中十分实用，来确证微生物污染的来源。Microbiological iden ification systems are based on different analytical meth dol gies, and limitations may be inherentto the method and r arise from dat ase limita ions. If a microorganism is not nclu

29、ded in the database it will not beidentified, so manufacturers should review the breadth of the database of the identification system they plan to use andits applicability to their needs.微生物鉴定体系包含不同的分析技术 方法学和数据库的局限会影响整个体系。如果未知微生物不在数据库中，则可能无法被鉴定。因此使用者需考察拟采 鉴定系统的广谱性是否满足使用需求。Sterility Test Failure Inve

30、stigation: 无菌检查过程回顾（环境、设施、设备、器材、操作、监控） 菌株分离分析（阳性结果、监控菌株等）； 微生物鉴别或鉴定； 可能性分析； 整改及验证 阳性结果判断及溯源性调查！如何与生产过程监管相衔接？National Institute of Food and Drug ntrolHttp:/四、微生物监控与溯源调查的策略实验室能力（应急体系）识别与区分监控体系的建设（调查的基础）关键环节基础数据库的建立（药品微生物污染菌库）实物与信息结果“异常”、监控“正常”，怎么调查？ 营养物质代谢试验 碳源和氮源利用试验 各种酶类试验表型鉴定表观生物学活性 API试验条 各种自动鉴定系统 16SrRNA分型 测序基因型鉴定核酸物质 脉冲场电泳 傅里叶变换红外技术全细胞信息色谱光谱质谱 GC TO不同来源的阴沟肠杆菌的FT-IR一阶导数光谱（1180-900cm-1）的比较蓝色来自实验室无菌阳性样品中的分离菌