鼻咽癌差异表达miRNAs筛选研究

1、鼻咽癌差异表达miRNAs挑选研究李晓霞，李瑞平，杜紫明，曾木圣，邵建永【摘要】【目的】应用iRNAs芯片挑选原代培养的鼻咽癌细胞差异表达iRNAs，并寻找差异表达iRNAs调控的靶基因，为进一步研究其在鼻咽癌发病机制中的作用打下基矗【方法】运用iRNAs芯片技术挑选原代培养的鼻咽癌细胞差异表达iRNAs，同时运用iRNAs特异的引物组对差异表达的iRNAs进展荧光定量RTPR验证。运用靶基因预测软件并结合全基因组表达谱芯片结果预测差异表达iRNAs可能调控的靶基因，并利用esternblt技术检测预测的靶基因在原代培养的鼻咽癌细胞中的表达。【结果】iRNAs芯片结果显示，鼻咽癌中iR-203

2、、iR-503、iR-424、iR-141和iR-148a表达下调，而iR-25、iR-195和iR-15a表达上调，其差异表达均在2倍以上；荧光定量RTPR结果与iRNAs芯片的结果较符合；其中iR-203的预测靶基因为NG1和SPAR，esternblt结果显示，其在原代培养的鼻咽癌细胞亦高表达。【结论】iR-203、iR-503、iR-424、iR-141、iR-148a、iR-25、iR-195、iR-15a在原代培养的鼻咽癌细胞与正常鼻咽上皮细胞中存在差异表达；NG1和SPAR可能是iR-203调控的靶基因，可能参与了鼻咽癌的发生开展。【关键词】irRNA；鼻咽癌；差异表达Abstr

3、at：【bjetive】TinvestigatethedifferentiallyexpressediRNAsandthEirtargetgenesinpriarynaspharyngealarina(NP)ells,hihareusefulfrfurtherstudiesnfuntinsfiRNAsinpathgenesisfnaspharyngealarina.【ethds】irRNAirarrayasusedtinvestigatethedifferentiallyexpressediRNAsinpriaryNPells,andthedisverediRNAserenfiredbyrea

4、ltieRT-PRassay.Furtherre,epreditedthepssibletargetgenesbybinatinantiipatedalgrithsandthehleexpressinprfilefgenefrpriaryNPells.esternbltasperfredtdetettheexpressinfthepreditedtargetgeneinpriaryNPells.【Results】irRNAirarrayshedthatexpressinfiR-203,iR-503,iR-424,iR-141,andiR-148aeredn-regulatedinpriaryN

5、Pellsbytflds,hileexpressinfiR-25,iR-195,andiR-15aereup-regulatedbyrethantfldst,hihasardantiththeresultsfrrealtieRT-PR.NG1andSPAR,thepreditedtargetgenesfiR-203,eredetetedtbehighexpressedinpriaryNPellsbyesternbltassay.【nlusin】iR-203,iR-503,iR-424,iR-141,iR-148a,iR-25,iR-195,andiR-15aeredifferentiallye

6、xpressedbeteenNPandNPNEells.NG1andSPAR,theputativetargetgenesfiR-203,ayplayaniprtantrleinthepathgenesisanddevelpentfNP.iRNAs(irRNA)是一类高度保守的非编码小RNAnd-dingsallRNA，一般为1925nt的单链型RNA，由60110nt的可形成发夹状的内源性转录前体加工而成。它们广泛存在于植物、动物以及病毒中1。iRNA与靶RNA的3UTR碱基配对，通过抑制RNA的翻译2或直接使RNA降解3，在转录后程度使基因产生沉默。越来越多的证据显示由iRNA调节的基因调

7、控机制作为基因表达程度调控的一种重要方式，与肿瘤的发生亲密相关，iRNAs很可能是一类潜在的癌基因或抑癌基因。对慢性淋巴细胞白血病(hrnilyphytileukeia,LL)的研究发现ir-15a和ir-16-1位于13q14染色体缺失域，50%60%的LL的患者存在ir-16-1和/或ir-15a的表达下调4，而iR-143和iR-145在结肠癌中表达下调5，Let-7在肺癌细胞中表达下调，RAS可能受到Let-7的调控6，并且50%以上的iRNAs的基因位于在人类癌症中发生缺失、扩增的染色体区域或染色体脆性位点，进一步说明了iRNAs与人类癌症的相关性7。鼻咽癌naspharyngeal

8、arina,NP是我国南方地区常见的恶性肿瘤。目前认为，遗传因素、EB病毒感染和某些环境因素与鼻咽癌的发生有关，但详细的分子发活力制尚不清楚。本研究应用iRNAs芯片筛查了原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞差异表达的iRNAs，并在对差异表达的iRNAs进展靶基因的预测的根底上进一步对其靶基因进了行验证，为进一步研究其在鼻咽癌发病机制中的作用打下基矗1材料和方法1.1材料5例原代培养鼻咽癌细胞NP8、NP31、NP43、NP44和NP47及5例原代培养鼻咽正常上皮细胞NPNE5、NPNE7、NPNE10、NPNE12和NPNE13标本均来源于中山大学肿瘤防治中心鼻咽科门诊。患者均为未承受过治疗

9、的门诊病人。鼻咽癌细胞株666由中山大学附属肿瘤防治中心实验研究部冻存。1.方法1.1细胞培养鼻咽原代细胞的培养方法参见文献，其中用于芯片的鼻咽原代细胞均经过生物学特性的鉴定资料未发表。666细胞用RPI1640培养基含有10%的FBS、50g/L链霉素和50g/L青霉素，细胞置于37，5%2的培养箱中。1.小分子RNA样品的别离与荧光标记取对数生长期细胞，Trizl一步法提取细胞总RNA，异丙醇沉淀法浓缩RNA，分光光度计测定总RNA的纯度，甲醛变性胶电泳质检总RNA的质量。取50100g总RNA用iRNAIslatinKit别离小于100nt的小分子RNA，详细方法按说明书进展。1.iRN

10、A芯片杂交及数据分析芯片由北京博奥生物芯片有限责任公司研制晶芯?誖哺乳动物iRNA微阵列芯片效劳V1.0芯片上一共有509个iRNA对应的探针。iRNAs芯片杂交、扫描和数据分析均在该公司技术效劳部完成，详细资料见网站.apitalbi.1.2.4生物信息学分析应用互联网上iRNA靶基因预测软件Pitar9、Targetsan10、iRbase11、iRanda12在线效劳站点，输出差异表达iRNA的预测靶基因，取至少3个软件预测到的基因作为靶基因。1.2.5荧光定量RT-PRiRNA的RTPR方法参照hen等13的方法。相应的PR引物见表1。采用U6RNA作为内标，进展归一化。1.2.6es

11、ternBlt分析分别取2例鼻咽癌原代细胞NP43，NP44和1例鼻咽正常上皮原代细胞NPNE5Trizl提取RNA后的剩余液，按照Trizl试剂说明书提取蛋白，-80保存待用。鼠抗人SPAR单克隆抗体；兔抗人NG1多克隆抗体均购自DAK公司。2结果2.1总RNA提取及质量鉴定结果样品总RNA的D260/D280之值在1.82.0之间。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，条带明晰，28S比18SRNA条带亮度接近21，RNA完好无降解，质量符合iRNAs芯片的质量要求(图1)。经iRNAIslatinKit别离，分别获得666、5例鼻咽癌原代细胞NP8、NP31、NP43、NP44和NP47及5例正常鼻咽

12、上皮原代细胞NPNE5、NPNE7、NPNE10、NPNE12和NPNE13的小分子RNA。2.2鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞差异表达iRNA分别将NPNE7和NPNE10，NPNE5、NPNE12和NPNE13样本小RNA混合后与芯片杂交，NP8、NP31、NP43、NP44和NP47样本小RNA分别与芯片杂交。杂交芯片经过扫描和数据整理后应用luster和SA软件输出，得到iRNA表达谱和差异表达iRNA表2。应用非监视等级聚类unsupervisedhierarhiallustering的方法将原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞的iRNA放到一起聚类，得到原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞i

13、RNA表达谱图2。结果显示在原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞中let-7家族、iR-29、iR-23、iR-24、iR-22和iR-221等高表达。应用SA软件tlassunpaired的方法挑选出24个鼻咽癌相关iRNAs，包括18个在鼻咽癌表达下调的iRNAs和6个在鼻咽癌表达上调的iRNAs。其中在鼻咽癌表达下调2倍以上的有：iR-203、iR-503、iR-424、iR-141和iR-148a共5个。在鼻咽癌表达上调2倍以上的有：iR-25、iR-195和iR-15a共3个。2.3差异表达iRNA的RT-PR验证结果采用荧光定量RT-PR的方法检测了芯片中显示表达下调的iR-203在

14、几个原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞中的表达，同时对表达上调的iR-195，iR-25，iR-15a在NP47的表达进展了检测，并采用U6进展归一化。iRNAs定量PR扩增曲线和溶解曲线(图3)，显示溶解曲线呈单峰，引物的特异性较好。我们又将芯片结果与荧光定量RT-PR结果进展比拟(图4)，结果显示在NP31、43、44、47中iR-203表达下调；在NP47中iR-195，iR-25，iR-15a表达上调，iRNA芯片与定量RTPR的结果一致，说明本研究芯片结果真实可靠。2.4iR-203靶基因预测结果选择鼻咽癌下调的iR-203进展靶基因的预测。通过四个靶点预测软件pitar，targe

15、tsan，iRanda，iRBase预测iR-203可能的靶基因。为了减少假阳性率，我们只挑选至少出如今3个软件中的基因作为其可能的靶基因，共挑选出46个基因。我们将先前预测的靶基因与全基因组差异基因表达谱相比拟发现，在这46个预测的靶基因中，有5个基因表现为上调表达，它们是：SPAR，NG1，ID2，INSIG1和ITED2，有3个基因表现为下调表达，其余基因无明显变化或者无数据。2.5esternblt检测预测靶基因的表达在原代培养的鼻咽癌细胞中下调表达的iR-203，其预测两个的靶基因是NG和SPAR。它们在原代培养的鼻咽癌全基因组表达谱芯片中表达都上调，进一步利用esternblt技术

16、检测原代培养的鼻咽癌细胞中NG和SPAR的表达，结果显示在原代培养的鼻咽癌中NG1和SPAR蛋白高表达(图5)，提示在鼻咽癌中iR203可能调控一系列基因表达包括NG1和SPAR基因。3讨论近年来，iRNAs作为生物体重要的基因调控分子，与疾病的关系尤其是与肿瘤的关系备受关注。随着iRNA芯片技术的开展，现已明确在多种肿瘤中存在iRNAs的异常表达或缺失，推断iRNAs很可能是一类新的癌基因或抑癌基因。有研究者运用iRNAs芯片对慢性淋巴细胞白血病(hrnilyphytileukeia,LL)的研究发现2个iRNAs的基因，即ir-15a和ir-16，位于13q14染色体缺失区域，50%60%

17、的LL的患者存在ir-16和/或ir-15a的表达下调4，iR-143和iR-145在结肠癌中表达下调5，Let-7在肺癌细胞中表达下调，在A549肺腺癌细胞中转染并表达Let-7，导致肿瘤细胞生长抑制14，这些均提示iRNAs已经成为研究肿瘤发生开展机制的一个新领域。目前iRNAs在鼻咽癌中的研究尚未见报道，我们以iRNAs芯片为平台初步研究了鼻咽癌iRNAs表达谱，发如今原代培养的鼻咽癌细胞与正常鼻咽上皮细胞的之间存在24个差异表达iRNAs，其中18个iRNA在鼻咽癌中表达下调，6个iRNA在鼻咽癌表达上调。在鼻咽癌表达下调2倍以上的有：iR-203、iR-503、iR-424、iR-1

18、41和iR-148a共5个；在鼻咽癌表达上调2倍以上的有：iR-25、iR-195和iR-15a共3个。Iri等15用基因芯片研究了乳腺癌的iRNA，共发现了29个明显的差异表达的iRNA，其中iR-10b,iR125b，iR-145是下调的，而iR-21,iR-155是上调的，推测他们可能分别做为肿瘤的抑癌基因和原癌基因。结合生物信息学的方法，使iRNA功能的研究更简单，而且有可能开拓一条新的研究道路，逐一找到iRNA的靶基因并提醒他们的功能。研究人员设计了多种计算机软件，对iRNA靶基因预测具有较高的准确性，应用Pitar，tangetsan，iRanda，irBase等iRNA预测软件，

19、对前面实验得出的鼻咽癌细胞下调表达的iR-203的靶基因进展检索和研究。我们选取至少在三个软件中出现的基因作为iR-203的靶基因，发现其靶点非常广泛，涉及到癌基因，细胞周期调控，细胞分化，转录调控，信号转导通路基因等46个潜在可能的靶基因。结合本组鼻咽癌细胞人类全基因表达谱结果未发表资料，其中有5个基因为上调表达，它们是：SPAR，NG1，ID2，INSIG1和ITED2，有3个基因表现为下调表达，其余基因无明显变化或者无数据。在表达上调的5个靶基因中，我们挑选SPAR和NG1来进展蛋白程度的验证，结果说明相对于正常鼻咽上皮细胞，SPAR和NG1在鼻咽癌细胞中是高表达的，由此我们认为SPAR

20、和NG1可能是iR-203的靶基因之一。较早期时研究者认为iRNA是与靶RNA形成不完全互补双链来阻遏翻译。然而u等3的研究那么说明其调节基因表达机制不尽如此。他们认为iRNA除了阻遏翻译外，还可引起RNA快速脱腺苷酸化而被降解以抑制基因表达。这种对iRNA的研究在理论上丰富了我们对iRNA基因调控的认识。ylinG1参与DNA损伤后检查点调控、DNA修复和凋亡，细胞增生，并且在很多细胞增生活泼的组织/病变中都可以看到ylinG1的过度表达。ylinG1可以和GAK，DK5，pRb互相作用参与多种凋亡通路。分泌性富含半胱氨酸的酸性蛋白(seretedprtienaidiandrihinystE

21、ine,SPAR)又称作骨连接蛋白(stenetin)，编码基因位于染色体5q31-33。SPAR作为一种调节细胞外基质的糖蛋白，又是抗粘附蛋白，与某些基质成份、生长因子和细胞因子作用，参与组织重建、形态生成、细胞迁移和增殖，调节机体的生理和病理过程。近来发现SPAR在多种肿瘤中表达异常，尤其是有证据说明SPAR异常表达与肿瘤的侵袭和转移关系亲密，抑制肿瘤细胞SPAR的表达，不但可以减少体外黑色素瘤肿瘤细胞的侵袭和粘附才能，而且还可完全遏制其致瘤才能。近年来，SPAR在肿瘤内皮的表达被确定，被论证为与P-2和肿瘤生长因子-相似的调节血管生成的相关基因。综上所述，本研究首次以iRNAs芯片技术，

22、对鼻咽癌iRNAs表达谱进展研究，发现鼻咽癌细胞存在一系列上调和下调的iRNAs；定量RTPR验证结果说明该iRNA芯片技术可靠。专业靶点预测软件预测鼻咽癌下调表达iR-203的靶基因，发现其靶点非常广泛，涉及到癌基因，细胞分化，转录调控，信号转导通路等。将iRNA芯片，靶点预测结果以及基因表达谱芯片结果综合分析，推断SPAR和NG1可能是iR-203的靶基因，为进一步研究iR-203在鼻咽癌发生开展过程中的功能奠定了基矗【参考文献】AIX,SHAFERA,LUS,etal.Epstein-BarrvirusirRNAsareevlutinarilynservedanddifferential

23、lyexpressedJ.PlsPathg,2022,2(3):e23.DAVIDPB.irRNAs:genis,bigenesis,ehanis,andfuntinJ.ell,2022,116(2):281-297.ULG,FANJH,BELASJG.irRNAsdiretrapiddeadenylatinfRNAJ.PrNatlAadSiUSA,2022,103(11):4034-4039.ALINGA,DUITRUD,SHIIZU,etal.FrequentdeletinsanddnregulatinfirRNAgenesiR15andiR16at13q14inhrnilyphytile

24、ukeiaJ.PrNatlAadSiUSA,2002,99(24):15524-15529.IHAELZ.ReduedauulatinfspeifiirRNAsinlretalneplasiaJ.lanerRes,2022,1(12):882-891.JHNSNS,GRSSHANSH,SHINGARAJ,etal.RASisregulatedbythelet-7irRNAfailyJ.ell,2022,120(5):635-647.ALINGA,SEVIGNANI,DUITRUD,etal.HuanirRNAgenesarefrequentlylatedatfragilesitesandgenireginsinvlvedinanersJ.PrNatlAadSiUSA,2022,101(9):2999-3004.宗永生，吴秋良，林素暇，等.EB病毒相关性疾病病理学研究的进展J中山大学学报：医学科学报，2022，265：481-487.KREKA.binatriali