细菌内毒素检查1.细菌内毒素检查基础理论

1、细菌内毒素检查基础理论湛江安度斯生物有限公司2017年5月细菌内毒素检查基础理论热原细菌内毒素内毒素标准品鲎和鲎试剂BET水BET操作要求BET器具要求供试品溶液制备相关参数计算2（一）热原热原的定义：是指能引起恒温动物体温异常升高的物质的总称，可分为外源性热原和内源性热原。外源性热原内源性热原细菌、病毒、真菌、螺旋体和疟原虫等白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子和干扰素等3热原反应：临床上在进行静脉滴注大量输液时，由于药液中含有热原，病人在短时间内出现发热、寒颤、恶心、呕吐、头痛等症状，严重者甚至可休克，危及生命。这种现象称为热原反应。（一）热原4（一）热原热原检查法 家兔法定义：系

2、将一定剂量的供试 品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温 升高的情况，以判定供试品 中所含热原限度是否符合规 定。5（一）热原热原检查法 家兔法优点：能直观地反映各种热原致热程度；缺点：不能定量反映热原含量，不易标准化，结果重复性差，不适于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂，受动物个体差异影响大。6（二）细菌内毒素来源：细菌内毒素是革兰氏阴性细菌的细胞壁组分之一，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。内毒素是外源性热原之一种，具有致热性；普遍存在于自然界中，如水、土壤；人和动物对内毒素有一定的耐受力，当大量内毒素进入血液会引起发热反应。7（二）细菌内毒素化学成分及特性是革兰氏阴

3、性细菌细胞壁的组分之一是高分子量脂多糖（LPS）的复合物单体分子量介于10，000至20，000道尔顿典型地以100，000至500，000道尔顿的聚合体形式存在8化学结构LPS含有3个截然不同的区域O-特异侧链或O-抗原核心多糖类脂A9与BET相关的特性致热性耐热性酸碱性鲎反应性分子极性需要在250摄氏度干热30分钟以上才能彻底灭活多糖链端有亲水性，脂肪链端具有疏水性，在水中呈不均匀分布内毒素作用于人体细胞，使之释放内源性热原，再刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶与强酸强碱发生水解反应，可灭活内毒素除上述性质外，LPS还有许多其它的生物活性10细菌内毒素

4、的量值细菌内毒素国际单位：IU；中国药典：内毒素单位（EU）表示；中国药典2010年版第一次明确提出： 1EU=1IU11细菌内毒素与热原的关系热原=内毒素？内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原，在GMP条件下控制内毒素污染就等于控制热原污染。细菌内毒素外源性热原热原内毒素只是热原中的一种12细菌内毒素分类指经人工提取精制并经生物效价测定的纯脂多糖（LPS)用作BET的参考标准品或对照品环境内毒素是天然的内毒素,普遍存在水、空气及各种原料中成分除了脂多糖外还含有其他杂质BET的对象是环境内毒素 标准内毒素环境内毒素13本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判

5、断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查法（BET）14凝胶法限度试验半定量试验光度法浊度法显色法动态浊度法动态显色法终点浊度法终点显色法细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法分类供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。15细菌内毒素检查法优点：简单、快速、灵敏，可定量测试，生产过程监控和家兔法不能检测的样品缺点：对细菌内毒素以外的热原不灵敏，有的供试品存在干扰，不能消除。目前尚不能完全替代家兔法。16问题讨论：药典的BET法中规定，当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。如何理解这句话？是不是说明凝

6、胶法比其它的方法更准确？17内毒素检查方法的合法性根据中国药典细菌内毒素检查法，细菌内毒素检查方法可分为供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。凝胶法限度试验 凝胶半定量试验动态浊度法 终点浊度法动态显示法 终点显示法18什么是争议情况？争议的情况是指：检测同一样品出现不同结果的情况。为了使这一争议结束，于是采用一种方法来进行仲裁，使争议事件得以解决。19为什么选择凝胶法作为仲裁试验？试验条件的要求较低（371，602分钟），使其容易标准化规范的细菌内毒素检查实验室操作熟练的实验人员进行操作使用经过校准的恒温仪、移液器或刻度吸管使用标准试剂内毒素参考标准品鲎试剂国家参考品凝胶法的普及程度

7、高20为什么选择凝胶法作为仲裁试验？光度法试验不容易标准化需在特定的仪器中进行；使用的仪器和试剂不同：供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等不同21凝胶法真的比其它方法学准确吗？凝胶法鲎试剂灵敏度允许2 ，如果A为，B为2 ，则结果可能相差4倍对于产品干扰情况的判断（尤其是假阳性的判断）远不及光度法22争议情况的“高发地段”争议结果高发于内毒素含量的临界值（即内毒素限值的50%至200%）。 比方说：某供试品内毒素限值为0.5EU/ml，当其实际内毒素含量为0.251.0EU/ml的时候。假阳性或假阴性结果23造成争议情况的原因试剂方法学试验条件样品24如何避免争议情况的发

8、生设置比药典更严格的内控限值，设置至少24倍安全系数选用光度测定法对产品的内毒素进行定量的、直观的检测25细菌内毒素的清除方法冲洗适用于器械组件、塞子等可用加热等方法提高清除效率蒸馏折流系统和地心引力阻止大分子量的LPS转变为蒸汽状态逸出反渗透超滤活性炭吸附26细菌内毒素的灭活方法酸/碱水解氧化H2O2干热250，30分钟的干烤27 工作标准品（CSE）细菌内毒素标准品参考标准品(RSE)国家标准品（NSE）国际标准品（IS）（三）细菌内毒素标准品细菌内毒素标准品的分类28细菌内毒素国家标准品细菌内毒素国家标准品（细菌内毒素检测用）批号：150800-201601效价：9000EU/支用途：用

9、于标定、复核 、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，以及细菌内毒素检查法中的相关实验。启用时间：2017年4月10日对应第一批工作品：150601-201782294月10日起生产的鲎试剂须使用新国标进行标定，并使用新国标或工作标准品进行灵敏度复核及样品检验；4月10日前生产的鲎试剂在使用时既可 使用原批国标或工作标准品，也可 使用现批国标或工作品进行灵敏度复核及样品检验。2017.4.1030细菌内毒素国家标准品-活性炭吸附力实验专用31（三）细菌内毒素标准品细菌内毒素工作标准品凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验；光度法中标准曲线可靠性试验。干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备；3

10、2（三）细菌内毒素标准品目前CSE的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）浮动效价法（国际） RSE价格比较昂贵，通常情况下BET实验只需使用CSE。33细菌内毒素标准品固定效价法无论试验方法和鲎试剂批号，同一效价！34细菌内毒素标准品浮动效价法35细菌内毒素标准品浮动效价法不同试验方法、不同鲎试剂批号，效价不同！36细菌内毒素标准品的使用使用前使用中使用后放置室温确认效价确定复溶体积混合时间混合效果贮存37效价不同批次CSE效价不同固定效价法：标明 ？ EU/支浮动效价法：厂家向用户提供效价分析证书（CoA）； 注明：RSE/CSE ？ EU/ng； ？ ng/瓶复溶根据使用说明书或CoA加

11、液溶解；复溶2ml安瓿装的内毒素标准品，为了避免溶液在混合时溢出安瓿，我们建议在安瓿颈部上方开口加液。混合时间按说明书或CoA要求储藏-按说明书要求保存开口部位细菌内毒素标准品的使用38标准品溶解后，需要按说明书要求旋涡混合；每稀释一步均应旋涡混合30秒钟至1分钟-保持一致！具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布；标准内毒素溶液的制备吸附聚集解决吸附聚集的方法：旋涡混合！39标准内毒素溶液的制备建议稀释倍数不要超过10倍；稀释是误差的最大潜在原因；一般来说小的稀释倍数（10倍）比大的稀释倍数误差小；稀释应该在无内毒素、无干扰的容器中进行；将稀释方案标准化以减少误差；如果内毒素溶液需要储存

12、，储存条件要经过验证（时间、温度、容器、溶液浓度和体积）；在稀释管上标记浓度和加液量，避免差错。40现状：1.CSE开启溶解后室温放置，随用随取；28冰箱放置，随用随取；28冰箱放置，当天使用；当次使用后丢弃；2.制备常用浓度的内毒素溶液，某条件下保存，随用随取；你呢？细菌内毒素标准品的使用41说明书验证细菌内毒素标准品的使用按照说明书要求使用；对保存条件进行验证（标准品溶液的有效期和稳定性研究）。42（四）鲎和鲎试剂鲎，是一种海洋生物，蓝色的血液，已存在超过4.4亿年，有“活化石”的美称。蓝色血液 鲎434445鲎试剂：鲎的变形细胞（阿米巴细胞）溶胞物的无菌冷冻干燥品。鲎试剂主要用途检测内毒

13、素和葡聚糖（四）鲎和鲎试剂检测注射用药品、生物制品、医疗器械的内毒素含量是否符合规定药品、生物制品生产过程中内毒素的监控临床血液、体液中内毒素含量和葡聚糖的检测监控水、食品中的内毒素污染46（四）鲎和鲎试剂鲎试剂的分类根据鲎的种类分类：美洲鲎试剂（LAL）中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL）根据检查方法分类：凝胶法鲎试剂光度法鲎试剂47 鲎试剂的质量标准鲎试剂质量标准：中华人民共和国卫生部部标准鲎试剂:WS1-364(B-123)-91灵敏度自身凝集缓冲能力干燥失重48鲎试剂灵敏度（ ）在细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生坚实凝胶的标准内毒素的最低浓度，单位为EU/ml。常用的凝胶法鲎试

14、剂灵敏度：0.5 EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml按标示灵敏度使用49鲎试剂灵敏度（ ）光度法鲎试剂灵敏度：试剂标示检测范围，如100.01EU/ml;标准曲线的最低浓度为该实验的检测灵敏度（ ）举例：某批号光度法鲎试剂标示的检测灵敏度范围是100.01EU/ml。某用户在实验时，使用标准内毒素制备标准曲线的系列浓度是2.0，0.25，0.03EU/ml。此实验的检测灵敏度为0.03EU/ml。50鲎试剂的规格一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量试剂）把自身的包装容器作为反应试管的试剂称为单次试验试剂。多次试验试剂有0.5ml

15、/支、1.25ml/支等，使用时应先用相应量的溶解液复溶鲎试剂。51放置室温后再复溶使用；检查试剂的灵敏度、批号和有效期；按照试剂的规格，加入溶解液复溶；BET水鲎试剂复溶液复溶鲎试剂后，应避免强烈振动产生泡沫，建议使用新鲜制备的鲎试剂溶液；由于鲎试剂与内毒素凝集反应的不可逆性，反应过程中必须避免反应试管的振动造成假阴性；尽量避免在水平超净台的下风开启鲎试剂。鲎试剂可以稀释吗？不可以！52鲎试剂的使用Peptide-pNA（显色寡肽） C因子405nm测光度值pNA（对硝基苯胺，黄色）Peptide凝固酶凝固酶原活化B因子B因子活化C因子内毒素凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶）G因子活化G因子葡聚糖或

16、LAL-RM凝胶法、浊度法显色法旁路反应鲎试剂与内毒素的反应机理53（五）细菌内毒素检查用水灭菌注射用水；内毒素含量；凝胶法：内毒素含量0.015EU/ml光度测定法：内毒素含量0.005EU/ml对内毒素试验无干扰作用。建议：用同一厂家鲎试剂、内毒素工作标准品、检查用水和辅剂进行试验！应用不同厂家试剂可能存在不匹配问题。54（六） BET操作要求试验过程应防止内毒素的污染。关于BET实验室的要求：2010年版实验室控制系统GMP实施指南55YY/T 0618-2007 细菌内毒素试验方法 常规监控与跳批检验美国国家标准ANSI/AAMI ST72:2002 细菌内毒素试验方法 常规监控与跳批

17、检验56建议：干净整洁的实验环境避免较大空气对流，引起尘埃飞扬；试验时不要开窗或者电风扇；空调通风口不要对着操作台；实验室温度在25以下；实验室验证：灵敏度复核试验或标准曲线可靠性试验注意：防风、防尘！57（六）BET操作要求试验操作，防止内毒素污染；手指避免接触瓶子、西林瓶、酶标板和稀释、反应试管的边缘；不要在西林瓶、瓶子、酶标板或试管开口的上方操作；开启试剂时要小心，特别是鲎试剂和水；在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内毒素进入供试液。吸取不同浓度的样品或内毒素溶液，要换无热原刻度吸管或吸头。需要时，请用无粉手套！58试验操作，防止内毒素污染当

18、心，非常危险！59试验操作，防止内毒素污染小心哦！我怕碰！60试验操作，防止内毒素污染61试验操作，防止内毒素污染62（七）器具要求凡是要与实验样品或试剂接触的器具，必须无内毒素无干扰耐热器皿常用干热灭菌法（250、30 分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。验证：细菌内毒素灭活验证试验；灭菌后用具保存时间：需验证，并保存记录；检测（建议）用具细菌内毒素含量；干扰情况；631.浸泡2.除标签、记号3.去杂质4.清洗5.冲干净、晾干6.泡酸玻璃用具的清洗、除热原648.蒸馏水/纯化水冲洗9.晾干后包装干烤7.自来水冲洗玻璃器具的清洗、除热原 试验中所使用的玻璃仪器清洁与

19、否，直接影响试验结果。干净、无残留（杂质、酸、洗涤剂）!65（七）器具要求当心玻璃器皿的材质！有的材料经过灭菌后会有溶出物，对BET试验有抑制/增强作用。玻璃器皿：首选硼硅酸盐玻璃！验证：在容器中加入BET水，测试灭菌前后干扰情况。66（七）器具要求若使用塑料器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。检测（建议）：细菌内毒素含量；干扰情况；开启后有效期验证（如盒装吸头）；67（八）供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。溶于水的供试品：检查用水复溶、稀释；不溶于水的供试品：其他溶剂溶解（甲醇、乙醇、DMSO等），再用

20、检查用水稀释；制成饱和溶液、加热助溶、调pH、超声波助溶、制成盐、浸提等溶剂：无干扰、无内毒素！医疗器械：检查用水或生理盐水浸提制成供试品溶液；68（八）供试品溶液的制备必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的 pH 值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的 pH 值在 6.08.0 的范围内为宜 ，可使用适宜的酸、 碱溶液或缓冲液调节 pH 值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。供试品溶液和鲎试剂溶液比例：1：1。69（九）相关参数计算1内毒素限值的计算2最大有效稀释倍数3最小有效浓度4样品稀释过程中加液量的计算5计算举例701.

21、内毒素限值的计算内毒素限值(L)药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L=K/ML为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；711.内毒素限值的计算内毒素限值(L) L=K/MK为人每公斤体重每小时可接受的最大内毒素剂量，以EU/（kgh）表示注射剂K=5 EU/（kgh）；放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kgh）；鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kgh）；721.内毒素限值的计算内毒素限值(L) L=K/M M为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kgh）、mg/（kgh）或U/（kgh）表示。人均体重按60kg计算；人体

22、表面积按1.62 m2计算；注射时间若不足1小时，按1小时计算；供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。731.内毒素限值的计算内毒素限值(L) L=K/M M参照药品使用说明书或国家药典委员会编制的临床用药须知确定；如儿童用药剂量大于成人用药剂量，则以儿童剂量为准；对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品，可根据计算值适当调整，严格至计算值的1/2或1/3；741.内毒素限值的计算对于体积在100ml以上的复方静脉输液类品种，内毒素一般按0.5EU/ml计；对于国外药典已收载的，可参考国外药典规定的限值，与按公式计算出的数值比较，以严

23、格者为该品种的限值。75内毒素限值计算举例注射用头孢曲松钠舒巴坦钠用法用量：肌注或静注;成人,一般感染。每日肌注1.25g(头孢曲松钠1.0g舒巴坦钠0.25g)。下次肌注或静注。严重感染，每日2.5g(头孢曲松钠2.0g舒巴坦钠0.5g)。分2次给药。脑膜炎可按1日125mg/kg(头孢曲松钠100mg舒巴坦钠25mg).但总量不超过5g(头孢曲松钠4g舒巴坦钠1g)分2次给药。76内毒素限值计算举例5EU/ （kgh）（5000mg/2）/（60kgh）=0.12EU/mgL=77内毒素限值计算举例抗肿瘤药：注射用培美曲塞二钠，当注射用最大剂量为500mg/m2，5EU/ （kgh）500

24、 0.027 mg/ （kgh）= 0.37EU/mgL=78供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行检测；MVD按下式计算： MVD=cL/2.最大有效稀释倍数（ MVD）C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml；L为供试品的内毒素限值；为鲎试剂的标示灵敏度(凝胶法)；为标准曲线最低点浓度(光度测定法) 。79如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠（浓度为10mg/ml， L=0.20EU/mg）的最大有效稀释倍数为：10mg/ml0.20EU/mg0.25EU/ml= 8（倍）MVD=802.最大有效稀释倍数（ MVD）

25、凝胶法试验在MVD下进行检测的意义阳性: 供试品内毒素含量等于或大于内毒素限值浓度阴性：供试品内毒素含量小于内毒素限值超过MVD的稀释无效，除非只是以试验为目的小于MVD的稀释可提供一个安全系数812.最大有效稀释倍数（ MVD）如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠（浓度为10mg/ml， L=0.20EU/mg）的最大有效稀释倍数为8；以MVD稀释供试品进行检测，如果结果阳性，表明样品至少含0.20 EU/mg的内毒素 很明显产品不合格 ；以MVD稀释供试品进行检测如果结果阴性，表明样品内毒素含量小于0.20 EU/mg 很明显产品合格；以1:4 (1/2 MVD)稀释供试品进行检测如果结果阳性，表明样品至少含有0.10 EU/mg的内毒素 不能说产品不合格 以1:4 (1/2 MVD)稀释供