军团菌的分离培养与鉴定 福建省疾病预防控制中心

1、军团菌的分离培养与鉴定 福建省疾病预防控制中心2022年6月3日军团菌革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径0.30.5m，长约1.25m或更长，菌体一端有鞭毛.在含L-半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYE琼脂培养基上生长，通常需要在37 5%CO2培养箱培养2-10天。生长形成的菌落一般呈白色，也可能会从紫色变为蓝色，或是灰绿色。 初步在BCYE琼脂培养基上生长的菌落为刻花玻璃样，具有多型性.军团菌军团菌军团菌电镜图片军团菌科、属、种、血清型军团菌科 (Legionellaceae ）Legionella / Fluoribacter bozemanii / Tatlockia micdadei 军团菌

2、属：16s rRNA分析表明，在蛋白细菌系亚群中，军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起Q热病的coxiella burneti(贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。军团菌种：现已发现50个种（species），70多个血清型（serogroups)，至少有20个种可引起人感染。 种名发现时间 种名发现时间 种名发现时间 Legionella pneumophila1979Legionella maceachernii 1985Legionella geestiana 1993Legionella bozemanae 1980Legionella

3、 parisiensis 1985Legionella londiniensis 1993Legionella dumoffii 1980Legionella rubrilucens 1985Legionella nautarum 1993Legionella gormanii 1980Legionella santicrucis 1985Legionella quateirensis 1993Legionella micdadei 1980Legionella spiritensis 1985Legionella worsleiensis 1993Legionella pittsburghe

4、nsis 1980Legionella steigerwaltii 1985Legionella lansingensis 1994Legionella jordanis 1982Legionella israelensis 1986Legionella lytica 1996Legionella longbeachae 1982Legionella birminghamensis1988Legionella waltersii 1996Legionella oakridgensis 1983Legionella brunensis 1989Legionella taurinensis 199

5、9Legionella wadsworthii 1983Legionella cincinnatiensis1989Legionella beliardensis 2001Legionella feeleii 1984Legionella moravica 1989Legionella drozanskii 2001Legionella sainthelensi 1984Legionella quinlivanii 1990Legionella fallonii 2001Legionella anisa 1985Legionella tucsonensis 1990Legionella gre

6、silensis 2001Legionella cherrii 1985Legionella adelaidensis 1991Legionella rowbothamii 2001Legionella erythra 1985Legionella fairfieldensis 1991Legionella busanensis 2003Legionella hackeliae 1985Legionella gratiana 1991Legionella drancourtii 2004Legionella jamestowniensis1985Legionella shakespearei

7、1992军团菌种SpeciesNo. of serogroupsNo. associated with disease1. L. pneumophila15152. L. bozemanii223. L. dumoffii114. L. micdadei115. L. longbeachae226. L. jordanis117. L. wadsworthii118. L. hackeliae229. L. feeleii2210. L. maceachernii1111. L. birminghamensis1112. L. cincinnatiensis1113. L. gormanii1

8、114. L. sainthelensi2215. L. tucsonensis1116. L. anisa1117. L. lansingensis1118. L. erythra2119. L. parisiensis1120. L. oakridgensis1120个种的军团菌可引起人疾病军团菌操作生物安全性应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。生物安全级实验室，最好在安全柜中操作。操作人员培训。菌种保存。可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定病原菌名称危害程度分类实验活动所需生物安全实验室级别运输包装分类学名中文名大量活菌操作动物感染实验样本检测非感染性材料实

9、验A/BUN 编号Legionella pneumophila嗜肺军团菌第三类BSL-2ABSL-2BSL-2BSL-1BUN 3373样本的采集和运输（一）标本的种类 （二）标本的运输和相关生物安全要求标本的种类 环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水, 加湿器水； 病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。 1983年新疆从一瘫患羔羊后肢中分离到军团菌。标本的运输和相关生物安全要求在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止受热和阳光,标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室,室温下(21+3)贮藏在实验室或其他地方。对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，

10、应放在-20冻存备用。水样标本中军团菌的分离方法检测依据: 1 、ISO-11731水质军团菌检测 2 、 公共场所集中空调通风系统 卫生规范中的集中空调通风系统冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌的检验方法见附录A。 适用于各种环境标本军团菌检测 ，包括： 饮用水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉淀物、软泥等物质。军团菌水质检测概括采样浓缩培养分离鉴定军团菌检测所需准备基本试剂培养基（GVPC，BCYE,BCYE-CYS)试剂 (生化试剂、甲醛的盐溶液）酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱缓冲液（0.03mol/L KOH）血清学试剂标本浓缩所需准备仪器设备过滤滤器及漏斗，过滤装置需能

11、够承受高压。正压膜蠕动过滤泵，能够控制流速。尼龙或聚碳酸酯滤膜 硅胶管 离心机 离心力能够达到（6000100）g,要有安全盖。漩涡振荡器 转速至少能够达到（2005）r/min。培养检测所需准备材料直径大约为90mm或100mm的无菌培养皿培养箱，CO2能够恒温保持在（361）。水浴箱，能够保持在（501）显微镜或荧光显微镜。样品采样准备材料玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理。水样一般采集为250-500ml，收集在容器瓶中。如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的热水（不低于70）或蒸汽进行巴斯德氏消毒，时间不低于5分钟。小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物。广口的容器

12、：用来收集淤泥等，要有螺丝盖。灭菌棉拭子。一般建议用塑料包装的容器采样后样品处理方法与步骤样品处理1. 沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或1000r/min离心1min去除。2. 过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径0.220.45m滤膜过滤，取下滤膜置于15ml灭菌水中，充分洗脱，备用。3.热处理：取1ml洗脱样品置50水浴加热30min。4.酸处理：取5ml洗脱样品，调pH至2.2，轻轻摇匀，放置5min。ISO-11731水质军团菌检测浓缩标本酸处理酸缓冲液：仔细地量取17.4ml浓盐酸加到1L蒸馏水中，配成0.2mol/L的盐酸缓冲液；称14.9gKCl加到1L蒸馏水中，配成0.2mol/

13、L的KCl溶液。将3.9ml 0.2mol/L的盐酸溶液和25ml 0.2mol/L的KCl溶液混合，用1mol/L的KOH溶液调pH至2.20.2，装在一个带塞的玻璃瓶内，于室温暗处贮存，不要超过1个月。将110ml样品（浓缩或未浓缩的）放入带有螺旋帽的容器中，再将其6000g离心10min或3000g离心30min。用无菌吸管吸取上清，使体积变为原来的一半。用振荡器或用力混合，使沉淀重悬。加入酸缓冲液使体积和原来相同,并轻晃摇匀静置5min。样品浓缩离心过滤接种酸处理 热处理水样的正压膜过滤法安放滤膜；过滤；取膜；洗膜。水样的离心将200ml左右样品倒入容积为300500ml的无菌离心瓶中

14、；6000g离心10min，或者3000g离心30min，离心温度在1525之间；无菌操作去除上清；用520ml溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。水样浓缩物的贮存最好对样品立刻进行分析；标本于（62）储藏最多不超过14天。 对于军团菌来说，如果储藏于06，这种损失是最明显的。而且，温度在20或20以上时，异养生物的生长速度就会变快。 浓缩标本热处理向无菌容器中放入（10.5）ml（浓缩或未浓缩）的标本。在（501）水浴中放置（302）min。军团菌培养基Muller-Hinton琼脂第一次分离出嗜肺军团菌使用的培养基活性炭酵母抽提物琼脂，活性炭替代培了淀粉以去除培养基的毒性，并且氨基酸也逐渐被酵母抽

15、提物替代CYE琼脂CYE琼脂加入-酮戊二酸BCYE琼脂BCYE琼脂中含有选择性抗生素GVPC琼脂军团菌培养基 酵母浸出物（细菌级） 10.0g 琼脂 12.0g 活性炭 2.0g -酮戊二酸 1.0g ACES (2-乙酰基-2-氨基乙烷磺酸) 10.0g KOH（颗粒型） 2.8g L-半胱氨酸盐酸盐 0.6g 焦磷酸铁 0.4g 蒸馏水 补充至1000mlBCYE培养基L-半胱氨酸和焦磷酸铁溶液称取0.6g L-半胱氨酸盐酸盐和0.4g焦磷酸铁分别溶解于10ml蒸馏水中，制备新鲜的L-半胱氨酸盐酸盐溶液和焦磷酸铁溶液。分别通过0.22m的滤膜过滤除菌。贮存于无菌容器中，-20左右储存不得超

16、过三个月。BCYE-培养基配制将颗粒状ACES放入500ml蒸馏水中溶解。量取480ml蒸馏水，加入全部2.8gKOH颗粒，轻摇至溶解。将以上两种溶液混合，制成ACES缓冲液,用0.1mol/L KOH和0.1mol/L HCl溶液调节PH至6.9-7.0ACES缓冲液中加入活性炭、酵母浸出物、-酮戊二酸。摇匀。加入琼脂，微波稍化后，121高压15min。高压后，室温或水浴中冷却至50左右。在无菌条件下加入L-半胱氨酸溶液和焦磷酸铁溶液。按20ml量倒入直径为90100mm的平板中，培养基的最终pH值大约为6.9左右。待平板中的湿气干燥后，4左右储存于闭光的密闭容器中，最多可储存4周。GVPC

17、选择性培养基BCYE-琼脂培养基中添加下列抗生素万古霉素 0.001g/L多粘菌素B 80000iu/L放线菌酮 0.08g/L无胺甘氨酸 3g/LBCYE-Cys培养基 为不含L-半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培养基。按照配制BCYE培养基的方法配制，不加L-半胱氨酸。标本肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物水源血清 处理与制备水样处理与制备血清学检测方法：*间接荧光抗体染色法*试管凝集试验*微量凝集试验（参考）*DOT-ELISA法*间接血凝试验（参考）*ELISA法接种军团菌BCYE培养基接种军团菌选择性GVPC培养基37，5%CO2，培养3-14天挑可疑菌落革兰氏染色涂片镜检3

18、7,5%CO2,培养3-14天革兰氏染色阴性杆菌革兰氏染色阳性杆菌 纯培养 弃去 确认试验 血清玻片凝集试验 PCR检测 生化试验 选择培养基的接种一个GVPC培养基平板上可以接种0.10.5ml(浓缩或未浓缩) 未经处理的样品。用无菌的涂抹器将液体均匀的涂抹在培养基表面。用同样的方法尽可能快地将经过热处理的0.10.5ml标本接种在另外一块GVPC培养基平板上。再用同样的方法尽可能快地将经过酸处理的0.10.5ml标本接种到第三块GVPC培养基平板上。500ml水样过滤浓缩法将500ml水样于0.22um滤膜过滤然后放于5ml无菌水中超声波振动3分钟=浓缩样本或高速离心浓缩法将200ml水样

19、置于离心机6000g离心10分钟，15-25 =浓缩样本直接涂布法于GVPC（2个平板）上分别涂布0.2ml原液用PBS缓冲液0.01mol/L（PH7.2）稀释1：10的样本酸处理法2ml浓缩液+2ml酸缓冲液（PH2.0）摇匀50.5分钟热处理法2ml浓缩液于501水浴301分钟直接涂布法于GVPC平板上涂布0.1ml浓缩液，用PBS缓冲液稀释1：10的样本 涂布：0.2ml于GVPC平板涂布：0.2ml于GVPC平板孵育、平板观察及确认接种标本培养接种过的培养基静置直至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，在（361）培养7-10天。为了保证培养箱内的空气的湿度，可以在培养箱内放置一个盛水的

20、碟子。在每次观察培养物时，向碟子内注满新鲜的水（根据需要）。在含2.5-5.0% CO2的环境下培养有利于军团菌的生长。孵育6个GVPC平板/每份样本37，5%CO2，培养3-10天 菌落验证：从每一个平皿上挑取2个可疑菌落，接种血平板及接种BCYE和L半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板，3537培养2天，凡在BCYE琼脂平板上生长,而在L半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板及血平板不生长的则为军团菌菌落。平板的检查观察结果：在3-10天的培养期间内，每24天至少观察3次，因为军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖。军团菌菌落特点（1）军团军菌落通常呈灰白色，但也能呈蓝色、灰绿色、深褐色或深红色。一般表面光滑湿

21、润，边缘完整，并显示典型的毛玻璃样外观。在紫外灯下，某些种的菌落（博杰曼军团菌、高曼军团菌、杜莫夫军团菌、安绥军团菌、奇锐军团菌、斯泰戈瓦尔特军团菌、格瑞梯纳军团菌、图森军团菌、巴黎军团菌）能自动发出白色的耀眼荧光；某些种的军团菌也能发出红光。军团菌菌落特点（2）嗜肺军团菌的菌落呈暗淡的绿色，并常伴有浅黄色。为了避免军团菌被杀死，平板暴露于紫外灯下不能超过规定时间。值得注意的是，新发现的某些种的军团菌所具有的特征可能会和上述特征有所区别。 军团菌菌落特点可疑军团菌菌落的进一步鉴定BCYE或其他培养基上传代培养革兰染色镜检生化鉴定PCR检测军团菌特异性基因片段免疫荧光的方法确定军团菌的种类 BC

22、YE或其他培养基上传代培养（1）至少从每块GVPC平板上挑选出两个典型的军团菌菌落，在BCYE和BCYE-Cys培养基上传代培养，传代培养要在两种培养基上同时进行。在（361）至少培养两天。凡是在BCYE培养基上生长而在BCYE-Cys培养基上不生长的菌落即可初步认定为军团菌。 BCYE或其他培养基上传代培养（2）营养琼脂或血琼脂培养基可以代替BCYE-Cys培养基。如果在这三种培养基上都不生长，原来选择性培养基上的可疑军团菌菌落应该继续传代培养。橡树岭军团菌和幽灵湖军团菌在初次分离培养时需要L-半胱氨酸和铁离子，但随后在L-半胱氨酸缺失时生长微弱。BCYE培养基上传代培养革兰染色镜检军团菌是

23、革兰染色阴性，浅红色的短杆菌，直径0.30.5m，长约1.25m或更长，菌体一端有鞭毛，长时间培养后鞭毛可能变成长丝状。短杆状长丝状军团菌生化鉴定 军团菌生化特性生化试验结果触酶/弱+氧化酶-/+硝酸盐还原-尿素酶-明胶液化+水解马尿酸+淀粉水解弱+尿素酶试验阴性：培养基不变色阳性：培养基由黄色变为红色硝酸盐还原试验阴性：无红色出现阳性：呈现红色 进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。-萘胺具有致 癌性、故使用时应加注意。 明胶液化试验 将待试菌培养物穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于361 2.5-5.0%CO2培养2-3天后将培养基置于4 30分钟，取出观察。 阴性：凝固 阳性：不

24、凝固马尿酸水解试验将待鉴定菌株，于0.4mL马尿酸钠溶液中，制成浓厚菌悬液，于361水浴培养2h后，沿管壁加入3.5水合印三酮试剂，形成两层，如果产生蓝紫色至深紫色，为阳性反应。阳性阴性氧化酶试验阴性阳性触酶试验取细菌至载玻片上涂抹，加1-2滴3%过氧化氢水溶液。 若会迅速冒出气泡，则表示此细菌含有触酶，属于阳性反应。淀粉酶水解试验阳性反应：（淀粉被分解）琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培 养物周围出现无色透明环阴性反应：菌落周围无透明环确定军团菌的种型 Oxoid 的乳胶试剂盒可以鉴定出： 嗜肺军团菌血清1型; 嗜肺军团菌血清2-14混合型； L. longbeachae1和2型 ，L. bozemanii1和2型，L. dumoffii，L. gormanii，L. jordanis，L. micdadei， L. a