生物化学实验原理与方法

1、生物化学实验原理与方法8/31/2022SWAU第一章：生物化学物质的制备第二章：离心技术第三章：层析技术第四章：电泳技术第五章：基因克隆技术第六章：PCR技术第七章：生物芯片技术8/31/2022SWAU第一章:生化物质的制备 生化物质通常是指动物、植物和微生物进行新陈代谢时产生的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物。这些大分子物质在生物体内具有各种生理活性，这些活性的产生与其结构有着密切关系，因此，分离此类物质不能用一般的化学分离方法，而是采用比较特殊的方法。这些方法与一般的化学分离方法相比，有下列几个特点：1、生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种化合物，并且在分离过程中，这些化合

2、物仍在发生代谢变化，如蛋白质和核酸的水解。2、有些化合物的含量极微，如激素等。3、许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易变变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。4、生化分离制备几乎都在溶液中进行，影响因素很多，实验方法经验性较强。8/31/2022SWAU第一节：生物材料的选择选择生物材料的原则：有效成分含量多，稳定性好；来源丰富，保持新鲜；提取方法简单；有综合利用价值等。生物材料一般可以分为两大类：天然生物材料和人工生物材料。天然生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量较高的生物个体、器官或组织。人工生物材料又分为三种： 1、 新品种材料 2、组织培养材料 3、生物产品与生物制品

3、材料8/31/2022SWAU第二 节：细胞及组织的破碎细胞及组织破碎的方法多种多样，根据实验目的和材料的不同可以采用不同的 细胞破碎方法，细胞破碎方法大致可以分为四类：机械破碎： 研磨法；组织捣碎法；超声波法；压榨法；冻融法溶胀和自溶 溶胀：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象。 自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用，发生溶解的现象。化学处理 用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（SDS）处理细胞时，可以把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类物质，并导致整个细

4、胞破碎。生物酶降解 生物酶有降解细菌细胞壁的功能，在用此法处理细胞时，先是细胞壁降解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。8/31/2022SWAU第三节：生物分子的提取提取是在分离纯化前期，将样品研磨，把被破碎的细胞置于一定的溶剂（提取液）中，使某一类分子目的物释放到提取液中的过程。提取液应具备的条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、价格低廉、操作安全等。生物分子可以分为生物大分子和生物小分子。生物小分子的结构由较强的共价键决定；生物大分子中除共价键外，还含有较弱的共价键和次级键，故需温和的条件才能保证生物大分子的活性不被破坏。因此

5、，这两类生物分子的提取液成分和操作条件差别很大。1、生物小分子的提取2、生物大分子的提取 蛋白质和酶的提取 核酸的提取8/31/2022SWAU溶剂提取法原理:利用溶剂的溶解作用把所需物质从细胞中转移出来影响溶剂提取效率的因素（影响溶解度的的因素） 1、溶剂的性质：（根据相似相溶原理） 2、离子强度：离子强度是影响物质溶解度的主要因素，但离子强度对不同物质溶解度的影响不同，如高离子强度下DNA-核蛋白溶解度增加，而低离子强度下RNA-核蛋白溶解度增加；绝大多数蛋白质和酶，在稀盐溶液中溶解度增加（盐溶）。 3、PH值：溶剂的PH值影响溶质分子的解离状态，离子状态的物质，不能是阳离子还是阴离子都易

6、溶于水，而非离子状态的物质易溶于有机溶剂。 4、温度：温度的升高可以增加物质的溶解度。 5、去垢剂：去垢剂是一类既有亲水基又有疏水基的物质，可以分为阴离子、阳离子和中性去垢剂等，如SDS，Tween20，Triton X-100。8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU第四节：生物大分子的浓缩1、沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。 盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等 。 2

7、、吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。3、超过滤法：把提取液装入过滤装置，在空气或氮气的压力下，使小分子物质通过半透膜，大分子物质留在膜内。4、透析浓缩法5、减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压蒸馏装置中，在减压真空状态下进行蒸馏。6、冰冻干燥法8/31/2022SWAU一、硫酸氨盐析法原理：根基蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出，。盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子之间相互聚集并

8、从溶液中析出。8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU影响蛋白质盐析的因素 、蛋白质浓度对盐析的影响：蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉现象，分离效果不好；蛋白质浓度太稀，耗盐量过大，蛋白质回收率也低。一般为2.5%-3.0%的蛋白质浓度较适中。、离子强度和离子类型对盐析的影响：离子强度越大，蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象；离子半径小而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而价数低的离子对盐析影响弱。、对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解度越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将值调到蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。、温度对盐析的影响：在低离子强度或水中在一定范围内蛋

9、白质的溶解度随着温度的升高而增加；但在高盐溶液中，温度的升高有时反而下降。一般情况下在操作。8/31/2022SWAU二、有机溶剂沉淀法原理：有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。有机溶剂的沉淀作用主要是降低溶液的介电常数从而增强分子之间的相互作用，使其溶解度降低。对于具有表面水层的生物大分子来说，有机溶剂可破坏溶质分子表面的水膜，使这些大分子脱水而相互聚集析出。不同溶质要求不同浓度的有机溶剂，因此可用有机溶剂进行分步沉淀。优点：有机溶剂沉淀法分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤比较容易。缺点：对某些具有生物活性的大分子，容易引起变性失活，操

10、作常在低温下进行；分离效果差，共沉作用大；离子强度及离子种类对其也有影响。8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU三、透析浓缩法原理：天然或人工半透膜只允许小分子通过而阻碍大分子通过。当膜的两侧存在小分子浓度梯度差时，小分子就从高浓度一侧向低浓度一侧扩散，直至达到平衡，如果能不断去除扩散出来的小分子，从而达到分离纯化的目的。影响透析的因素 1、半透膜的通透性：半透膜的通透性取决于膜孔径的大小，在能阻碍大分子扩散的前提下，孔径越大，透析速度越快。 2、透析外液的更换 3、温度：温度越高，透析速度越快。 4、压力：用跨膜的压力梯度可加速大分子的分离速度。 5、溶剂8/31/2022SW

11、AU8/31/2022SWAU四、等电点沉淀法原理：利用两性电解质在等电点处溶解度最小的性质。不同的两性电解质其等电点不同，其在电中性时溶解度不相同。因而等电点沉淀法可用于某些两性电解质的分离如氨基酸、蛋白质、核苷酸等，为了增加沉淀效果，往往在等电点时再加上其他沉淀因素，所以幻灯片 2等电点沉淀法一般不单独使用，常和盐析法、有机溶剂沉淀法一起使用，以提高其沉淀能力。8/31/2022SWAU第二章：离心技术 第一节、离心技术的原理 当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。旋转速度越高，运动物体所受到的离心力越大。如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行高速水平旋转，强大的离心力

12、作用于溶剂中的悬浮颗粒或高分子，会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中心轴。在相同转速条件下，容器中不同大小的悬浮颗粒或高分子溶质会以不同的速率沉降。经过一定时间的离心操作，就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子溶质的有效分离。8/31/2022SWAU第二节、影响离心沉降速率的因素 球型颗粒在自然沉降过程中： 摩擦力F1=6rpdr/dt 浮力F2=(p-m )Vg V=4/3rP2 球形颗粒的自然沉降速率：dr/dt=2rp2 (p-m)g/9 在离心力作用下，非球形颗粒的沉降速率: dr/dt=2rp2(p-m)w2 r/9 (f/f0) 影响沉降速率的主要因素：颗粒半径rp的大小；颗粒形状；

13、颗粒与悬浮的密度差(p-m ) ；一定温度下悬浮介质的黏度系数；离心加速度w2r。 在确定的条件下，沉降速率主要取决于离心机的转速。8/31/2022SWAU第三节、沉降系数 dr/dt=2rp2(p-m)w2 r/9 (f/f0） s= 2rp2(p-m)/ 9 (f/f0） dr/dtsw2 r S为沉降系数，表示单位离心力场下的沉降速率即通过单位离心力场所需的时间，因此单位为秒。 8/31/2022SWAU沉降系数的作用： 1、描述颗粒的大小 2、预计沉降时间 对已知S值的物质，可预计在离心管中的沉降所需时间。 3、 测定物质的分子量 根据Svedberg公式可计算出分子量。 M=RTS

14、20,w/D20,w(1-V) R-气体常数，等于1.987卡/度.摩尔 T热力学温度 S20,w-标准状况下粒子的沉降系数 D20,w 理想状态时粒子的扩散系数 V 微分比容，等于溶质粒子密度的倒数 - 溶剂密度8/31/2022SWAU第四节、离心设备离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。根据转速的高低把离心机分为三种：低速离心机（转速在20006000r/min，最大RCF可达6000g）；高速离心机（转速在1800025000r/min，最大RCFd达60000g）；超速离心机（转速在40000100000r/min，最大RCF可达803000g）。根据离心机的性能可分为：分

15、析型，制备型和分析制备型。转头可分为：角度转头，垂直转头，水平转头。离心管及其管帽是转头重要的附件，制造离心管的材料主要有特种玻璃，塑料和不锈钢。8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU第五节、制备型超速离心法制备型超速离心法可以用来分离细胞，亚细胞结构或高分子。根据分离的原理的不同，制备超速离心法又可分为差速离心法和密度梯度离心法。一、差速离心法 原理及操作步骤： 差速离心法又叫分级分离法。装有不均一的粒子的离心管在离心机中高速旋转时，大小，密度不同的粒子将以各自的沉降速率移向离心管底部。如果设计一定的转速和时间，沉降速率最大的

16、首先沉淀在离心管底部，沉降速率中等及较小的组分继续留在上清液中。将上清液转移到另一离心管中，提高转速并掌握一定的时间，就可获得沉降速率中等的组分，如此反复操作，就可实现对不同组分的分离。 优点：操作简单。 缺点：效率低，费时，所得组分不单一。8/31/2022SWAU二、密度梯度离心法 原理： 离心操作在密度梯度介质中进行的离心方法。根据操作方法的不同，密度梯度离心法又可分为速率区带离心和等密度梯度离心。 1、速率区带离心： 速率区带离心法依据样品中各组分沉降速率的差别而使其互相分离。在离心管中灌制好预制的一种正密度梯度介质液，在其表面铺上一层样品溶液，离心期间，样品中各组分会按照它们各自的速

17、率沉降，被分离成一系列的样品组分区带，故称速率区带离心。 预制密度梯度介质的作用有二个，一是支撑样品，二是防止离心过程中产生的对流对已形成区带的破坏作用。但是样品液的密度一定要大于密度梯度介质的最大密度，否则就不能使样品各组分得到有效分离。 离心过程中，各组分的移动是相互独立的。因此，S值相差很小的组分也能得到很好的分离，这是差速离心法做不到的。但速率区带离心不适于大量制备实验。 8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU2、等密度梯度离心 依据粒子本身的密度差异而进行分离。如果离心管中介质的密度梯度范围包括待分离样品中所有组分的密度，离心过程中各组分将逐步移至与它本身密度相同的地方

18、形成区带，这种分离方法称为等密度梯度离心。 在等密度梯度离心中，组分的分离完全取决于组分之间的密度差。离心时间的延长或转速提高不会破坏已经形成的样品区带，也不会发生共沉现象。8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU三、速率区带离心与等密度梯度离心的区别 1、依据的原理不同 速率区带离心依据粒子的沉降速率被分离；等密度梯度离心依据粒子本身的密度差异被分离。 2、介质的梯度范围不同， 速率区带离心介质的密度小于样品中各种粒子的密度；等密度梯度离心介质密度大于样品各种粒子的密度。 3、时间效应不同 速率区带离心不能长时间离心；等密度梯度离心长时间离心将各种粒子停留在等密度位置形成区带。8

19、/31/2022SWAU8/31/2022SWAU第三章、层析技术 第一节、层析技术的原理原理：层析技术是层析分离技术是一种物理的分离方法，利用混合物中各组份物理化学性质的差别（如吸引力，分子形状和大小，分子的极性，分子亲和力，分配系数等），使各组分以不同程度分布度在两相中（其中一相为固定相，另一相为流动相），从而使各组分以不同速度移动而达到分离。 层析分离技术在上个世纪就已在生产实践上应用。1903年用于植物色素的分离提取，分离后的叶绿素和叶黄素等在碳酸钙的吸附柱上从上到下排列成色谱，故也称为“色层分离法”。1931年，有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构异构体，显示了这一分离技术的高

20、度分辨力，从此吸引了人们的广泛关注。自1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技术的发展越来越快。1950年以来，相继出现了气相层析，高压液相层析，薄层层析，薄膜层析，亲和层析，凝胶层析等8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU第三节、层析技术的分类分类：根据操作形式的不同，层析技术可分为纸层析，薄层层析和柱层析。 根据理化性质的不同，层析技术可分为吸附层析，分配层析，高压液相层析，吸附分配层析，离子交换层析，排阻层析，亲和层析，气相色普层析。 层析基本操作步骤： 1，选择适当的吸附剂 2，加样 3，展开 4，检出和鉴定8/31/2022SWAU第三节、 薄层层析

21、原理：以薄层板作为支持介质的层析。 在玻璃板上涂布一层支持剂，待分离样品点在薄层板一端，然后让推动剂从上流过，从而使各组分得到分离的物理方法。常用的支持剂：硅胶G，硅胶GF，氧化铝，纤维素，硅藻土，纤维素G，交联葡聚糖凝胶等。基本操作步骤：薄层板的准备；点样；展开；定位；定量。应用：氨基酸，多肽，蛋白质及酶，维生素，核甘酸，脂肪酸，脂类，糖类，磷脂，生物碱，酚类等物质的分离优点：设备简单，操作方便，快速灵敏，分析制备兼适8/31/2022SWAU第四节、聚酰胺薄层层析原理：用于层析的聚酰胺基团有两类：锦纶66（尼龙）和锦纶6，这两类材料中都含有大量的酰胺基团，故统称为聚酰胺。聚酰胺以其CO或N

22、H与极性化合物的OH或O之间形成氢键，从而发生吸附作用。不同物质与聚酰胺之间形成氢键的能力不同。在聚酰胺薄膜上做层析分离时，流动相从薄膜表面流过，被分离物质在溶剂和薄膜之间按分配系数的大小，发生不同速率的吸附与解吸过程，从而使混合物得到有序的分离。8/31/2022SWAU影响迁移率的主要因素 1、成键基团数目越多，吸附力越大 2、成键基团的位置，影响氢键数目和强度 3、芳香环，共双键越多，成键越强 4、被分离物质分子内氢键的形成，可以削弱它与聚酰胺之间氢键的形成 5、溶剂的影响 优点：对极性化合物有特异的分辨能力，灵敏度高，操作方便，速度快，样点不扩散，有荧光的物质可用紫外灯检出，不必喷显色

23、剂显色。 用途：分离多种化合物，在蛋白质或肽的N末端残基分析中是个比较理想的方法，对丹酰氨基酸的分析可达10910108/31/2022SWAU第五节、纸层析原理：依据物质在两相中分配系数的不同进行的分离。 分配系数是指一种溶质在两种互不相容的溶剂中达到平衡时，该物质在固定相和流动相中的浓度比，K=C固/C液 分配系数K与温度，压力，溶质和溶剂有关。在同一条件下，各种物质的分配系数不同，因此可以用纸层析进行分离。 纸层析以滤纸为介质滤纸纤维和水有较强的亲和力，能吸收22左右的水，其中67的水以氢键形式与纤维的羟基结合，在一般条件下较难脱去。而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力较弱，所以纸层析实际上是以

24、滤纸纤维及其结合水作为固定相，以其有机溶剂作为流动相。当有机相沿滤纸经过样品点时，样品点上的溶质在水相和有机相之间进行分配，一部分溶质离开原点随着有机相移动，进入无溶质区，此时又进行重新分配，沿着有机相方向移动。溶质中各种不同组分有不同的分配系数，移动速度也不同，从而使混合物得到分离。8/31/2022SWAU影响迁移率的主要因素 1、物质结构与极性 2、层析溶剂 3、PH值、温度、展开方式纸层析的应用：既可以用来定性，也可以用来定量。 1、剪洗法 2、扫描法8/31/2022SWAU第六节、凝胶层析一、原理：又称凝胶过滤，是一种柱层析方法。层析柱中装有水不溶凝胶颗粒，颗粒内部形成多孔的三维网

25、状结构，凝胶是高度亲水的，在水溶液里吸水膨胀，当在胶床表面加上分子大小不同的样品混合物并用洗脱液洗脱时，直径小于网孔的自由通透小分子可以进入胶粒内部，需层层扩散，流过的路程比较长，最后流出；而直径大于网孔直径的大分子不能进入胶粒内部，沿着胶粒的间隙向下流出，所经路程短，最先流出；通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出，从而按从大到小的顺序实现对大中小分子的分离。8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU二、常用的凝胶材料：交联葡聚糖，交联琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖，多孔玻璃，聚苯乙烯等。三、操作步骤 1、凝胶的选择和处理 2、凝胶柱的制备 3、加样

26、 4、洗脱 5、凝胶柱的再生和保存 四、优点：操作条件温和，适于分离不稳定的化合物，回收率高，分离效果好，重现性强，分离需时短，柱可反复使用。五、用途：广泛用于生化物质的分离，脱盐，制备，分子质量的测定等。8/31/2022SWAU第七节、离子交换层析一、原理：在含有可与周围介质进行离子交换的基质上进行化合物分离的方法叫离子交换层析。离子交换层析是根据物质的酸碱性，极性，和分子的大小的差异而进行的柱层析技术。二、离子交换材料：阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。带有酸性可电离基团的以SO3H表示，称为阳离子交换树脂；带有碱性可以电离基团以R4NOH表示，称为阴离子交换树脂。8/31/2022SWA

27、U8/31/2022SWAU三、离子交换层析的操作步骤 1、离子交换剂的处理、再生和转型 常规处理是加适量的水悬浮除去细颗粒，然后再用酸碱浸泡，以便除去杂质和使其带上需要的反离子；使用过的离子交换剂可采用酸、碱反复处理使其恢复原来的性质；改型是指离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程。 2、分离物质的交换 3、物质的洗脱与收集8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU四、离子交换层析前要注意以下几点： 1，离子交换剂的选择：考虑被分离物质带有什么样的电荷；分子的大小；物理化学性质等。 2，离子交换剂的准备：除去交换剂中的杂质；交换剂的溶胀；除去交换剂中细小的微粒；改型。 3，缓

28、冲液的选择：对阴离子交换剂应当用阳离子缓冲液；对于阴离子交换剂应用阴离子交换剂；缓冲液离子的PK值要在所用的PH值附近；缓冲系统的选择不影响分离物质的活性，溶解度，不干扰分析；选择的PH值决定于被分离物质的等电点，稳定性和溶解度。 五、应用：用来分离极性较强，电离度大的混合物。8/31/2022SWAU第八节、亲和层析一、原理：利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的分离方法二、基本操作：寻找能被分离分子（配体）识别和可逆结合的专一性物质配基；把配基共价结合到层析介质（载体）上，即把配基固定化；把载体配基复合物罐装在层析柱内做成亲和柱；上样亲和，洗涤杂质，洗脱收集亲和分子（配体），亲和柱再生。8

29、/31/2022SWAU8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU三、亲和层析介质载体的选择要求： 1，非特异性吸附作用要低，与其它大分子的作用很微弱。 2，必须具有很好的液体流动性 3，在较宽的PH，离子强度和变性剂浓度范围内具有化学和物理稳定性 4，必须具有合适的丰富的化学基团，配基可以共价地和它结合，并在连接的条件下是稳定的 5，必须具有非常有效的多孔性 常用的三种介质：琼脂糖（常用），聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球。8/31/2022SWAU四、配基的选择 配基是发生亲和反应的功能部位，也是载体和亲和分子之间的桥梁。 配基本身必须具备两个基团：一个能

30、与载体共价结合；一个能与被亲和分子结合 可以作为配基使用的物质有：酶底物的类似物；效应物；酶的辅助因子。 选择好的配基有两个标准：一是在蛋白质和配基之间必须有强的亲和力；二是必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与大分子特异结合，但可以用来连接配基和支持物，而且这种连接不影响配基和大分子结合的亲和力。 配基和支持物的结合方法：载体结合法；物理吸附法；交换法；包埋法。 8/31/2022SWAU五、应用 1、酶 2、抗原与抗体 3、结合蛋白和输送蛋白 4、受体蛋白 5、细胞及病毒 8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU第九节、气相色普一、原理：气相色普

31、与一般柱层析相似，是在柱内进行的。混合样品随固定流速的载气进入层析柱。此种样品必须是气态的，如果样品原是液态或固态，要使之进入层析柱的刹那间变成气态，层析柱内装有称为担体的颗粒状惰性支持物，其表面为一类具有高沸点的有机化合物均匀地包裹着，使担体表面形成以一层很薄的液膜，当样品气体进入层析柱遇到这种固定液时就能溶解在固定液中，它遇热又能挥发到载气里，并随载气的定向流动而向前推进，遇到新的固定相又被吸收，如此交替吸收和挥发，使样品蒸汽所经过的每一点都进行着固定相和流动相之间的分配平衡。由于样品中组分在固定相和流动相的分配系数不同，经过一段时间后原来均匀混合的样品彼此分离了，被分离的组分按先后次序被

32、载气带入鉴定器，在那里把进入的样品组分浓度转换成电压，经放大后在自动记录仪上记录下来。从给样到每一组分出现的层析峰s上的时间称为保留时间，不同化合物在一定条件下有其特定的保留时间，还根据峰面积来计算各种化合物的含量，这就是气相色普法中气液层析的简单原理 8/31/2022SWAU气相色普仪的组成 1 载气：常用的气体有氢气，氮气，氦气，CO2,氩气等， 2 层析柱：仪器的重要组成部分， 3 支持物（担体）：作用是支持固定液，这种物质无吸附性能，是惰性的，即不与固定相或要分离的组分起任何反应，高温下也不变性。 4 固定液：没有挥发性，对要分离的组分有足够的溶解能力。 5 样品：一般采用ug到mg

33、量范围，并尽可能以浓缩方式送入柱内。 6 鉴定器：是测定流出气体组分的装置，要求能迅速地反应组分的变化，有很好的稳定性，有足够的灵敏度，重复性好，而且结构简单，与组分无作用，有较宽的操作温度。8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU二、气相色普的特点： 1 气体粘度小，气相与液相间的质量传递速率高，容易达到平衡。 2 检查气体中的组分比检定液体的组分容易 3 气液色普法中固定相液体的选择范围很广，操作温度范围也很宽。 4 由于有灵敏的检测器，样品用量很少。8/31/2022SWAU三、应用 1、分析蛋白质和氨基酸 2、分析核酸 3、分析糖类物质 4、分析脂肪酸 5、分析农药8/31

34、/2022SWAU第十节、高效液相色普一、原理：高效液相色普仪一般由溶剂槽，高压泵，分析柱，进样器，检测器，部分收集器，记录仪，数据处理机等单元组成。 根据柱中担体种类的不同，其分离原理有以下几类：1，液液分配层析：利用溶质在流动相中的分配系数的差别而达到分离的目的。2，液固吸附层析：利用溶质被固体吸附剂吸附能力的差别而达到分离的目的。3，离子交换层析：通过溶质和树脂担体的交换作用，利用不同溶质离子交换能力的差别而达到分离目的。4，凝胶渗透层析：按溶质分子量大小而分离。8/31/2022SWAU二、高效液相色谱仪的组成 1、进样系统 2、输液系统 3、分离系统 4、检测系统 5、数据处理系统三

35、、应用 1、定性和定量分析 2、测定酶的活性 3、测定蛋白质的分子量 4、分离核酸和核蛋白四、优点：高效，高灵敏度，高速，定量准确和应用范围广。8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU第四章、电泳电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。8/31/2022

36、SWAU电泳的分类原则上按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。8/31/2022SWAU按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维素为支持介质，主要在医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白

37、，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。8/31/2022SWAU淀粉凝胶电泳：以淀粉为支持介质，多用于同工酶分析。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，可重复性较差，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。琼脂糖凝胶电泳：以琼脂糖为支持介质，一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质8/31/2022SWAU另

38、外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：板电泳和柱电泳。 据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量电泳、免疫电泳。8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU电泳槽及电泳仪水平板式电泳槽垂直板式电泳槽8/31/2022SWAU电泳条带8/31/2022SWAU第一节、基本原理电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。8/31/2022SWAU若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： F引=E Q （1）在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻=6rV (2

39、) 当F引=F阻时 EQ= 6rV (3) V= EQ/6r (4) 由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度()成反比。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。8/31/2022SWAU V= EQ/6r (4)在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 8/31/2022SWAU影响迁移率的因

40、素 V= EQ/6r (4) 由（4）可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，常用迁移率 m（或称泳动率，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况。 m = V/E = Q/6r （5） 由上式可以看出，迁移率仅与球形粒子所带电荷数量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。8/31/2022SWAU 由于蛋白质、氨基酸以及核酸等的电离度随溶液pH变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移率U为迁移率m和当时条件下电离度的乘积。 U = ma （6） 将（6）式代入（5）式得： m = Q/6r （5）

41、 U = Qa/6r （7）由（7）式可以看出，凡能影响溶液粘度的因素如温度，影响分子带电量Q及解离度的因素如pH的改变，都会对有效迁移率，产生影响。8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU 以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的情况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响因素外，有效迁移率还受电渗（是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动）的影响。电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。最后要考虑选用离子强度适宜的溶液。离子强度影响粒子的 电动势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，泳动速度越慢，反之越快。 总之，电泳受粒子本身大小、形状、所

42、带电量、溶液粘度、温度、pH、电渗及离子强度多种因素的影响。8/31/2022SWAU第二节、常用电泳支持介质一、聚丙烯酰胺凝胶(PAG) 是目前应用最广泛的电泳支持介质,其机械强度高,弹性好,透明,化学性质稳定,属于非离子型化合物,没有吸附和电渗现象。 、凝胶的组成聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂(过硫酸氨，APS）的作用下合成的。 凝胶的物理性质用凝胶浓度（T）和交联度（C）两个参数来描述：T%= （Acr+Bis/V）*100；C%=（Bis/ Acr+Bis）*100。 8/31/2022SWAU、影响凝胶孔径的因素 凝胶孔径大小主要受浓度的影响，浓度

43、越大，孔径越小。 凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断；浓度太小，凝胶稀软，不易操作。通常把7.5%的凝胶称为标准胶。当在标准凝胶浓度上分离效果不理想时，可以调整凝胶浓度。当凝胶浓度确定之后，交联度为5%时，凝胶具有最小的孔径。如果用聚丙烯酰胺凝胶分离大分子核酸，通常用大孔径凝胶。为了提高机械强度，最好加入0.5%琼脂糖或在3%的凝胶中加20%蔗糖。 8/31/2022SWAU、聚丙烯酰胺凝胶的合成、过硫酸氨TEMED化学催化聚合系统 在此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）称为加速剂，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使过硫酸氨（APS引发剂）形成自由基。这些自由基的产生可以引发丙烯

44、酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。、核黄素TEMED光聚合催化系统 在此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。8/31/2022SWAU4、聚丙烯酰胺凝胶的性能制作良好的聚丙烯酰胺凝胶与其他凝胶相比有如下优点：1、聚丙烯酰胺凝胶是人工合成三维网状结构的凝胶，具有分子筛作用，其筛孔的大小可人为控制和调节，并且制备重复性好。2、聚丙烯酰胺凝胶是碳-碳结构，没有或很少带有极性基团，因而吸附少，电荷作用小，不易和样品相互作用，化学性质比较稳定。3、凝胶无色透明，

45、适宜用光密度扫描记录结果，且需要样量较少。4、用途广泛，具有弹性，便于操作，易于保存。 由于其具有上述特点，特别适合做区带电泳的支持物，用于酶带的分离以及进行分子量的测定。8/31/2022SWAU二、琼脂糖凝胶 琼脂糖是一种直连多糖，在水浴中加热溶解，冷凝后靠糖链间的氢键作用形成凝胶 调整琼脂糖浓度，可获得不同孔径的凝胶，用作电泳支持介质。由于琼脂糖具有亲水性及不含带电荷的基团，因此很少引起敏感的生化物质的变性和吸附，是分离生物高分子尤其是核酸的优良电泳介质。用琼脂糖配置电泳凝胶，只需将琼脂糖在缓冲液中加热溶化，在将凝胶倒入电泳槽中即可。 聚丙烯酰胺凝胶浓度在2.4%20%，分离范围1.01

46、063.3102Da；琼脂糖凝胶浓度在0.1%2.5%，510851048/31/2022SWAU三、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别、分离范围不同琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。、凝胶配置程序不同琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。、凝胶的厚度不同琼脂糖凝胶最薄只能达到；聚丙烯酰胺凝胶可以制成.，分辨率高。、成本不同琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高、安全性不同琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性8

47、/31/2022SWAU第三节、非变性聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳 聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。所谓非变性凝胶，即在凝胶中不加变性剂，这种凝胶中，蛋白质的迁移率受它的静电荷与分子大小两个因素的影响。因此在非变性凝胶中进行电泳是不能测得分子量的。所谓变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺酸钠)、巯基乙醇、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋白质在这种变性凝胶中的迁移率与它们分子量的对数成直线关系。因此利用变性凝胶进行电泳可以

48、测得蛋白质的分子量。目前应用较多的变性剂为SDS。本节介绍非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳原理与方法 8/31/2022SWAU二、聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理：在区带电泳的基础上，以不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进行分离。三、根据缓冲液的PH值的高低，可分为碱性系统、酸性系统和中性系统8/31/2022SWAU碱性系统碱性系统的组成1、分离胶，由T=7.5%，C=2.5%的单体溶液和PH8.9的Tris-HCl缓冲液经过硫酸氨催化聚合而成的小孔径凝胶。被浓缩的样品

49、进入分离胶后，在电荷效应和分子筛效应共同作用下得到分离。2、浓缩胶，由T=3%，C=2%的单体溶液和PH6.7的Tris-HCl缓冲液组成，经催化聚合而成的大孔径凝胶。它使样品在进入分离胶之前被浓缩成薄层，从而提高了电泳分离的分辨率3、样品胶，由T=3%，C=20%单体溶液、待分离样品溶液以及PH6.7的Tris-HCl缓冲液。主要起抗对流的作用使样品不被电极缓冲液稀释。8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU8/31/2022SWAU碱性系统的三种物理效应1、浓缩效应 是由于柱胶中凝胶层的不连续性、缓冲离子成分的不连续性、PH的

50、不连续性及电泳开始后产生的电位梯度不连续性综合作用 形成的。2、电荷效应 蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所带有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个圆盘区带。在进入分离胶时，电荷效应仍起作用。3、分子筛效应 当被浓缩的蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶时，pH值和凝胶孔径突然改变，选择分离胶的pH值8.9接近甘氨酸的Pka值（9.79.8），这样慢离子的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加。此时慢离子的有效泳动率超过了所有蛋白质的有效泳动率。这样，高电势梯度不存在了，各种蛋白质仅会由于其分子量或构型的不同，在一个均一的电势

51、梯度和pH条件下通过一定孔径的分离胶时所受阻滞的程度不同，表现的泳动率的不同而被分开。8/31/2022SWAU四、操作步骤1、凝胶的制备2、样品的准备3、加样4、电泳5、剥胶6、固定7、染色8、脱色9、结果记录8/31/2022SWAU1、凝胶的制备 配制凝胶前，应把玻璃管装好。装玻管的方式很多：在凝胶架的孔洞内，加少许40%蔗糖溶液，然后把洗净干燥的玻璃管套上乳胶管，插入架的孔洞内，使玻璃管、乳胶管与孔底相平；玻璃管的一端用青霉素瓶盖封口，或者用附有玻璃短柱的乳胶管封口；底平坦的玻管也可用橡皮膏布封口，封口的玻管安放在试管架上；也可把玻璃管用橡皮筋捆扎在一起，一端搞平后放在培养皿中，然后用

52、1%琼脂趁热倒在培养皿中，冷却后，玻璃管口即被琼脂凝胶封住。 配制凝胶时，先将所需的贮备液自冰箱中取出，放至室温下预温。 聚丙烯酰胺凝胶通常只制备二种胶。先制备分离胶，再在分离胶上面制备浓缩胶，样品胶一般不制作，这是因为有些样品会抑制胶聚合；光照可引起某些蛋白质变性；多了一道手续，延长制胶时间。8/31/2022SWAU、分离胶的制备：按比例混合贮存液，(先不与过硫酸铵混合)，放在真空干燥器中抽气，排除溶液中空气。抽气后在贮存液中加入过硫酸铵混匀，用注射器沿玻璃管壁慢慢注入胶液，各支玻管注入的量要相同，或按事先作好标记，注胶到相同的高度。务必勿使气泡出现。为了使凝胶表面平整，在凝胶表面再慢慢地

53、加入一层水，约35mm高度，消除凝胶的弯月面。加水要小心，切勿冲乱界面。加水的另一作用是隔绝空气中氧与胶液接触。以防影响顶部胶层的聚合。注射器中残留的胶液要立即清洗掉，以防胶液在针头与注射器中聚合，而使其损坏。 水层放好后，静置30分钟，使凝胶进行化学聚合反应。聚合最适温度为25。当水刚加入胶面时，水与凝胶形成一界面，后界面慢慢消失，当凝胶聚合时，水与凝胶之间又出现界面。界面的再出现表明凝胶已经聚合，再静置2030分钟，聚合便完全。 8/31/2022SWAU、浓缩胶的制备：分离胶聚合好后，用注射器小心吸去水层，用滤纸条吸去残余的水。按比例混合浓缩胶液(也预先抽气，抽气时不要与核黄素混合，使用

54、时再混匀)，先用这种凝胶液漂洗一下分离胶顶，除去漂洗液后，再用注射器加浓缩胶溶液1cm左右，各管加的高度应一致，并在上面加水层压平胶面。放在两只20W以上功率的日光灯下，约离灯管1015cm处，光下聚合60分钟左右，当浓缩胶由浅黄色变为不透明的乳白色，即聚合完成，取出水层，吸干后用电极缓冲液洗涤，准备加样。浓缩胶应临用前制备。 8/31/2022SWAU2、样品的准备 聚丙烯酰胺盘状电泳可用于分离各种蛋白质、核酸等样品。例如血清、唾液、细胞膜蛋白，动植物及微生物的各种蛋白提取液，昆虫的体液，各种酶制品，色素蛋白复合体以及核糖核酸等。初学者可用现成的蛋白质样品如血清练习操作。 盘状电泳所需要的样

55、品是很少的。一个标准凝胶管按体积，需要5100l的样品(约0.12mm高)；按含量需要5100g。实际上就是用0.1%浓度的样品5100l。由于样品组分的不同，用量可有一定的幅度。对于只含有少数组分的样品，通常用1020g，对于含有多种组分的样品，可用到200g。即每一凝胶的样品容纳量不仅指所加的样品总量，更重要的是指样品混合物组分的量。所加样品液量的精确性将影响重复性，误差要不大于5%。 近来，样品胶一般已改用样品液中加入5%20%的蔗糖或10%甘油代替，因为样品胶的作用主要是抗对流，蔗糖液和甘油能起同样的效果。 8/31/2022SWAU 如果样品离子强度太高，会引起分界面模糊不清，严重时

56、完全不能进行电泳。因离子强度太高时降低了蛋白质的电动电位，同时电导过高，在样品部分几乎没有电势梯度，以至样品的泳动速度近于零，不能泳动。硫酸铵盐析的样品或柱层析高盐浓度的洗脱部分，必须透析除盐，务必使其电导低于分离胶的电导，以便形成足够的电势梯度，使区带在分离之前进行浓缩变窄。 如果样品过稀，加样体积太大时，相应地加厚浓缩胶层。玻璃管也要适当加长。通常稀样液与浓缩胶的比不大于11.2。 一个生物样品（粗抽提物），常需要事先经过处理(高速离心，微孔滤膜过滤，柱分离等)去除沉淀，消除混浊。或只取可溶性部分进行电泳。不然常有许多物质留在凝胶与缓冲液的界面上，阻塞凝胶，干扰分离。当样品装载量与样品溶解

57、度不相应时，也会在浓缩胶上或浓缩胶与分离胶界面上产生沉淀，并造成拖尾现象（随着电泳过程，沉淀逐渐溶解，逐渐进入）。 8/31/2022SWAU3、加样 加样前先把密封下口的物件除去，如果是拔橡皮帽，应先让空气进去，再拔管子，防止凝胶拉坏。下槽中放满缓冲液，把玻管固定在盘状电泳槽上槽的洞中。安装时要特别注意保证凝胶管垂直和橡胶塞孔密封不漏。管的下端悬一滴电极缓冲液。先在下槽放上电极缓冲液，再把上槽放在下槽上，避免管下有气泡。然后加样。 加样方法因人习惯不同而略有差异。有的把样品与增加比重的蔗糖及指示剂先混在一起加样；有的指示剂单独加在玻璃管中或在上槽电极缓冲液中滴上几滴指示剂。加样时，有的先加好

58、样液，再在样品上加几滴缓冲液，然后在样液上加电极槽缓冲液；有的先在上槽中加满电极缓冲液，然后用加样器插在缓冲液中往胶管浓缩胶上方加样。总的原则，先提高样品的比重，后加样，加样和加电极缓冲液互不干扰。8/31/2022SWAU4、电泳 在电泳槽中注满电极缓冲液。缓冲液应事先在冰箱中预冷，上槽电极缓冲液必须浸没玻管和电极。连接直流稳压电源，缓冲液系统为碱性时上槽为负极，下槽为正极。缓冲系统为酸性时则相反。Davis标准状态的凝胶电泳，负极在上，正极在下，电泳槽一般放在冰箱中，保持温度在04。打开电源开关，调节电流，开始时用12mA/管，电泳35分钟后，再逐渐升高到4mA/管。不要一开始就电流很高。

59、电流最好不要超过5mA/管。太高的电流强度会造成产热量大，使分离失败。如果高温对样品不利，可降低电流，延长时间，或进行有效冷却，在整个电泳过程中，一般要求电流保持稳定。电泳时间与所用缓冲液和样品有关，一般根据指示剂的迁移来决定，如果指示剂已迁移到凝胶柱的下口附近，或已迁移管长的3/4距离时，就可停止电泳，关闭电源，取出玻璃管。上槽电极缓冲液可连续使用几次，但必须每次测一下PH，如PH值发生改变就不能再使用。每次电泳后，下槽中混入了催化剂及氯离子，如将下槽缓冲液用于上槽，则影响电泳。重要的电泳，电极缓冲液最好用新鲜的。8/31/2022SWAU5、剥胶 为了防止电泳后凝胶中蛋白(酶)盘状区带扩散

60、，电泳完毕必须立刻取出凝胶柱进行固定与染色，一般用2030ml的注射器配上10cm长的针头，左手拿玻管，右手握灌满水的注射器，将针头插入凝胶与管壁之间，左手慢慢旋转玻管，右手一边压水，一边使针头呈螺旋式推进。靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，一般情况下，针头抽出，胶就自动滑出。如果不出，就从另一端再注水或用洗耳球在一端稍加压力。如果胶浓度较高，取出困难，可用10%甘油水溶液代替水注入。一般剥胶的方向是从浓缩胶端开始。剥胶时应注意不要损伤胶柱表面。8/31/2022SWAU6、固定 为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需要进行固定。剥出的凝胶柱只要浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中