表没食子儿茶素没食子酸酯和米糠蛋白的相互作用

1、表没食子儿茶素没食子酸酯和米糠蛋白的相互作用苗向硕 吴伟 吴晓娟（中南林业科技大学食品科学与工程学院 稻谷及副产物深加工国家工程实验室 长沙 410004）基金项目：国家自然科学基金面上项目（31771918）收稿日期：2019-01-21作者简介：苗向硕，女，1994年出生，硕士研究生，粮油深加工通信作者：吴伟，男，1981年出生，教授，粮油深加工通信作者：吴晓娟，女，1984年出生，工程师，粮油深加工摘 要 采用荧光光谱和紫外-可见光谱法研究表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）和米糠蛋白（Rice bran protein，RBP）之间的相

2、互作用。结果表明：EGCG对RBP有较强的荧光猝灭作用，为且动态和静态混合淬灭。EGCG与RBP在290、300、310K时相互作用的表观结合常数分别为1.3228106、1.5042106、1.8176106 L/mol，对应的结合位点数分别为1.3878、1.3270、1.3770。同步荧光光谱、紫外-可见光谱和三维荧光光谱表明EGCG主要影响RBP色氨酸残基空间结构的微环境，使其周围的疏水性下降。热力学参数表明EGCG与RBP结合的主要作用力为疏水相互作用。根据Fster非辐射转移理论计算了不同条件下EGCG与RBP结合距离r为0.8004 nm。建立了不同温度下EGCG与RBP结合率的

3、理论模型，发现RBP的结合率随着EGCG浓度增大而减小，温度对两者的结合率无显著影响。关键词 米糠蛋白 表没食子儿茶素没食子酸酯 相互作用 荧光光谱 紫外吸收光谱中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1003-0174（2019） - -米糠是稻谷籽粒的精华所在，虽然只占稻谷质量的6%8%，却集中了64%的稻谷营养素和90%以上的人体必需元素。米糠含有11%17%的米糠蛋白（Rice bran protein，RBP），是一种重要的植物蛋白资源。RBP过敏性低，其氨基酸组成与FAO/WHO推荐的氨基酸组成的理想模式非常接近，生物效价高，是一种公认的优质植物蛋白，可广泛应用于包括

4、婴幼儿食品在内的各类食品中1。表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是绿茶儿茶素中的主要成分，约占儿茶素的50%80%，EGCG因其高含量和优异的生物活性而被认为是茶多酚中最重要的成分2-3。EGCG具有良好的抗氧化性，其淬灭自由基的能力比维生素C和维生素E还要强，由于EGCG安全无毒且抗氧化作用很强，使得食品在较长时间保持其原有的色泽和营养水平，有利于延长食品保质期、改善食物品质。因而广泛应用于焙烤食品、糕点、乳制品、肉制品及水产品等4。EGCG 在食品体系中会与蛋白质发生相互作用，进而改变蛋白质的结构特征和功能特性，因此EGCG和各类食品蛋白

5、质相互作用成为研究热点。目前已有报道主要集中于EGCG与动物蛋白（牛乳铁蛋白5、牛血清蛋白6和-乳球蛋白7）相互作用的研究，而鲜有关于EGCG与植物蛋白相互作用的研究报道。近年来富含RBP和EGCG的食品在国内外均有报道4, 8, 9，但缺乏RBP与EGCG相互作用机制方面的研究，本文采用荧光光谱、紫外-可见光谱研究RBP与EGCG相互作用，为开发富含RBP和EGCG食品及调控此类食品品质提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂新鲜米糠 湖南粮食集团有限责任公司；EGCG（纯度98%） 杭州怡倍嘉茶叶科技有限公司；其它试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。1.2 仪器与设备Sor

6、vall LYNX 6000高速落地离心机：美国Thermo Fisher公司；FD5-4冷冻干燥机：美国GOLD-SIM公司；F4600荧光分光光度计：日本日立公司；Blue Star紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份公司。1.3 方法1.3.1 RBP提取参考吴伟等10方法提取RBP。新鲜米糠除杂过40目筛，随后与正己烷以1:5（g:mL）料液比混合脱脂，重复脱脂五次。将脱脂米糠和去离子水以1:10（g:mL）混合，用2 mol/L NaOH溶液调pH值至9.0，在40、120 r/min下搅拌提取4 h，随后以8000 r/min在4下离心20 min，取上清液用2 mol/L H

7、Cl调pH至4.0，静置20 min后在4条件下以8000 r/min离心20 min得到RBP沉淀，水洗RBP沉淀3次后将沉淀分散于5倍体积的去离子水中，用2 mol/L NaOH溶液调pH至7.0，采用截留分子量3500 u的透析袋透析24 h脱盐，最后冷冻干燥得到RBP。1.3.2 荧光光谱测定取2 mL浓度为1.5mg/mL的RBP溶液加入10 mL试管中，随后加入梯度体积2 mg/mL的EGCG溶液，再用pH 7.0的0.02 mol/L 的磷酸盐缓冲液定容至3 mL，使得最终RBP浓度为1 mg/mL，并得到质量比为（1:0，1:0.02，1:0.04，1:0.06，1:0.08，

8、1:0.10，1:0.12，1:0.14，1:0.16，1:0.18，RBP:EGCG，w/w）的RBP-EGCG混合液，充分混匀后，分别在17、27、37 的恒温水浴锅中保温5 min。在激发波长为290 nm，发射波长为300500 nm，激发和发射狭缝宽度分别为5和10 nm ，扫描速度1200 nm/min的条件下测定RBP荧光光谱。1.3.3 同步荧光光谱测定样品制备同1.3.2，测定温度为300K，分别固定 15 nm和60 nm，激发和发射的宽度分别为5和10 nm，扫描速度1200 nm/min，扫描250450 nm范围内的同步荧光光谱。1.3.4 三维荧光光谱测定样品制备同

9、1.3.2，起始激发波长为 200 nm，激发波长设置在200350 nm的范围内，发射波长设置在200500 nm的范围内，激发和发射狭缝宽度分别为5和10 nm，扫描速度1200 nm/min，每隔10 nm记录1次，共扫描 31 次。1.3.5 紫外-可见光谱测定取3 mL质量浓度为1 mg/mL的RBP溶液于石英比色池中，扫描250350 nm波长范围内的吸收光谱。扫描完毕后，将不同质量浓度的EGCG-RBP混合液充分混合后加入到比色池中，放置5 min后扫描吸收光谱，测定温度为300 K。以相同质量浓度的RBP溶液作空白，记录RBP溶液的紫外-可见吸收差谱。1.3.6 EGCG与RB

10、P结合距离的测定EGCG溶液紫外光谱的测定步骤：移取3 mL质量浓度为0.03 mg/mL的EGCG溶液于石英比色池中，紫外吸收光谱的波长扫描范围为 300500 nm。RBP溶液荧光光谱的测定步骤：移取3 mL质量浓度为1 mg/mL的RBP溶液于石英比色池中，设置激发波长为290 nm，发射波长为300500 nm，激发和发射的狭缝宽度分别为5和10 nm，扫描速度1200 nm/min，测定温度为298 K。2 结果与分析2.1 EGCG与RBP相互作用的荧光光谱2.1.1 EGCG浓度对RBP内源荧光光谱的影响蛋白质内源荧光反映RBP中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基微环境的变化，进而能够

11、表征EGCG对RBP结构的影响4。由于EGCG荧光发射信号非常弱，对RBP荧光信号的干扰可以忽略，因而本研究中不考虑“内滤光效应”的干扰问题11。如图1所示，随着EGCG浓度的增加，一方面RBP的荧光强度明显下降，说明EGCG和RBP之间存在较强的相互作用；另一方面RBP最大发射峰从358.4 nm逐渐红移至 377.2 nm，表明随着EGCG浓度的增加，RBP中芳香族氨基酸残基微环境由疏水性逐渐向亲水性转变，说明RBP空间结构逐渐处于更加延伸的状态12。 图1 不同浓度EGCG对RBP内源荧光光谱的影响注：RBP质量浓度为1 mg/mL；110 ：EGCG质量浓度分别为0、0.02、0.04

12、、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18 mg/mL。图2、图4同。2.1.2 EGCG浓度对RBP同步荧光光谱的影响同步荧光光谱可表征EGCG对RBP中酪氨酸残基和色氨酸残基微环境的变化，=15 nm 时仅显示酪氨酸残基的光谱特征，=60 nm时仅表现色氨酸残基的荧光5。由图2可以看出，随着EGCG浓度的增加，RBP色氨酸和酪氨酸残基的同步荧光强度降低，且色氨酸残基的荧光淬灭程度更大，表明EGCG对RBP的荧光淬灭主要作用于色氨酸残基。当=15 nm时，酪氨酸残基最大发射波长为368.4 nm，随着EGCG浓度的增加没有发生明显变化；当=60 nm时，随着EGC

13、G浓度的增加，色氨酸残基最大发射波长由288 nm逐渐红移至292.2 nm，表明EGCG和RBP作用时主要影响的是色氨酸残基微环境。 = 15 nm; B = 60 nm图2 不同浓度EGCG对RBP同步荧光光谱的影响2.1.3 EGCG浓度对RBP三维荧光光谱的影响三维荧光光谱中的峰位、指纹信息和荧光强度可以科学、可靠地反映蛋白质的组成分布和特征构象变化。图3中可以看出，峰a表示瑞利散射峰（Ex=Em），峰b是二级散射峰（Em=2Ex），峰1代表RBP的色氨酸残基产生的特征峰，峰2代表多肽链主链结构的特征峰，这些都是三维荧光光谱中的典型峰13。如图3所示，随着EGCG浓度的增加，峰1的颜色

14、变浅，轮廓线更细，等高线变得稀疏，说明EGCG可使得RBP荧光强度显著降低，表明EGCG与RBP之间发生了强烈的相互作用。加入EGCG后峰2等高线变得密集，区域面积发生变化，表明EGCG-RBP复合物的形成使得蛋白质多肽链的骨架发生变化，蛋白的结构发生改变。由表1可知，色氨酸残基的最大发射波长发生红移，表明色氨酸残基所处环境的疏水性逐渐降低，极性增加，与同步荧光光谱的结果一致。EGCG使得峰a和峰b的荧光强度降低的原因可能是EGCG与RBP结合后，破坏了RBP表面的保护水层，RBP变得更加分散，引起RBP粒径变小，光散射作用减弱，从而使这两个散射峰的荧光强度减弱，这说明EGCG与RBP之间形成

15、了不发光基态复合物。BA图3 未添加EGCG（A）和EGCG添加浓度为0.08 mg/mL（B）的RBP的等高线图表1 EGCG-RBP体系三维荧光光谱的特征参数体系峰类型峰位置Ex/Em(nm/nm)荧光强度RBP峰1峰2峰a峰b280/360240/480300/300350/350200/400250/500720.2198.79999.99999.9367.6-922EGCG（0.08mg/mL）+RBP峰1峰2峰a峰b290/370210/420300/300350/350200/400250/500112.738041359999.9540.91482.2 EGCG与RBP相互作用

16、的紫外-可见吸收光谱由图4可知，随着EGCG浓度的增加，RBP吸光度逐渐升高，出现明显的增色效应，同时，最大吸收峰波长发生红移，由280 nm增加至302 nm，表明EGCG与RBP相互作用引起了蛋白质结构变化，形成了基态复合物。结合前面荧光光谱结果推测，EGCG-RBP复合物最大吸收峰波长的红移，可能是由于EGCG使RBP中色氨基酸残基发生位移或被结合，形成新的共轭体系，使-*跃迁能量增大14。图4 不同浓度EGCG对RBP紫外-可见吸收光谱的影响2.3 EGCG与RBP相互作用机制2.3.1 荧光淬灭机制由荧光光谱可知，EGCG对RBP荧光具有明显的猝灭作用，通过对其淬灭机制分析，可以更准

17、确地判断EGCG与RBP是否形成了复合物11。荧光淬灭机制可分为动态淬灭、静态淬灭和动态静态混合淬灭3种。动态猝灭是由荧光团和猝灭剂之间的碰撞引起的，随着温度升高，动态猝灭常数会增大。静态猝灭是由于荧光团和猝灭剂之间形成了基态复合物，由于复合物的稳定性通常会随着温度升高而下降，因而其猝灭常数则会随温度升高而降低11。因此，可利用Stern-Volmer方程7求解不同温度下EGGC和RBP相互作用的淬灭常数，从而判断其淬灭机制。Stern-Volmer方程如下： （1）式中：F0是未加入EGCG时的荧光强度；F是加入EGCG时的荧光强度；Q为EGCG浓度（mol/L）；Kq为双分子猝灭过程速率常

18、数（L/（mols）；Ksv为动态猝灭常数（L/mol）；0为猝灭剂不存在时荧光体的寿命（生物大分子的平均寿命约为10-8 s）。根据公式（1），以 Q为横坐标作图，F0/F 为纵坐标，得到不同温度下 EGCG 对RBP猝灭的 Stern-Volmer 曲线（图5）。由图中直线的斜率和0可得到不同温度条件下EGCG与RBP相互作用的Ksv和Kq，结果见表2。当相关系数0.98时，表明在这一系列浓度下可能存在动态和静态混合的淬灭机制15。如图5所示，Stern-Volmer曲线在低EGCG浓度时线性相关，高EGCG浓度时逐渐偏向y轴，说明同时存在静态和动态淬灭6，并且Ksv随着温度的升高而有所增

19、大，说明EGCG淬灭RBP内源荧光的机制存在因分子间碰撞导致的荧光淬灭，即动态淬灭。同时，由于不同温度曲线下的 Kq远大于最大动态猝灭速率常数（约为21010 L/(mols)），表明EGCG 对RBP的猝灭机制也存在因分子间生成不发光基态复合物的静态淬灭，结合其荧光光谱和紫外-可见吸收光谱出现的变化分析，静态淬灭在EGGC对RBP的荧光淬灭过程中起主导作用16。相关研究同样发现EGCG与-乳球蛋白17和鲢鱼肌球蛋白18相互作用时同时存在静态荧光淬灭和动态荧光淬灭。图5 不同温度条件下EGCG对RBP荧光猝灭的Stern-Volmer方程曲线图表2 EGCG-RBP复合物的荧光淬灭常数及相关系

20、数温度/KKsv/ ( L/moL)Kq/ (L/(mol.s)相关系数R22902.26611042.266110120.943003.43421043.434210120.983103.52421043.524210120.972.3.2 EGCG-RBP复合物的结合常数、结合位点数及作用力当小分子独立地与大分子上的位点结合时，结合常数（KA）和结合位点数（n）可以通过以下等式确定19： （2）式中：F0表示没有猝灭剂时的荧光强度；F表示有猝灭剂时的荧光强度；KA为表观结合常数；n为结合位点数；Q为猝灭剂的浓度。图6显示log (F0-F)/F对log Q的双对数曲线，由拟合曲线的斜率和截

21、距得到n和KA（表3）。从表3中可以看出，结合常数 KA 的数量级达到106，而相关研究表明EGCG与牛血清蛋白6、-乳球蛋白7和鲢鱼肌球蛋白18相互作用的KA数量级分别为104、104和105，小于本文EGCG与RBP的相互作用KA数量级，表明EGCG与RBP之间的结合力较强，这可能是由于RBP与牛血清蛋白、-乳球蛋白和鲢鱼肌球蛋白结构差异引起的。KA 值随着温度的升高而增大，也表明EGCG与RBP相互作用时存在动态淬灭。在不同温度条件下n均约等于1，表明EGCG与RBP有1个相对独立的结合位点，且n值随温度的变化不明显，同样表明EGCG与RBP发生了较强的相互作用，类似现象在茶多酚与大豆分

22、离蛋白11、EGCG与-乳球蛋白17、EGCG与鲢鱼肌球蛋白18相互作用的研究中也有报道。图6 不同温度条件下EGCG荧光猝灭RBP的双对数曲线表3 EGCG-RBP复合物的结合位点数、表观结合常数及相关系数温度/KKA / ( L/moL)结合位点n相关系数R22901.32281061.38780.99273001.50421061.32700.99313101.81761061.37700.9686小分子和蛋白质之间的结合力主要包括疏水相互作用、静电引力、范德华力、氢键等，热力学参数H和S是确认作用力的主要依据。当H 0、S 0、S 0 时，分子间的作用力主要是疏水相互作用；当H 0时，

23、分子间的作用力主要是静电引力；当H 0、S 0，表明EGCG与RBP之间的相互作用为吸热反应，升温有利于反应的进行，这与结合常数KA随着温度的升高而逐渐升高相吻合。H 0、S 0说明EGCG 与RBP之间的作用力主要为疏水相互作用。表4 不同温度下EGCG与RBP相互作用的热力学参数温度/KH/(kJ/mol）S/(J/(molK)G/(kJ/mol）29011.8682158.0159-33.956430011.8682158.0159-35.536631011.8682158.0159-37.11672.3.3 EGCG与RBP的能量转移和结合距离根据Fsters偶极-偶极非辐射能量转移理

24、论7，蛋白质和小分子配体之间发生能量转移应该满足以下条件: 蛋白质能产生荧光；小分子配体的紫外光谱和蛋白的荧光发射光谱发生重叠；给体和受体的结合距离小于7 nm。综合EGCG与RBP的荧光光谱和紫外-可见光谱，由以下公式可计算EGCG与RBP的重叠积分J、能量转移效率E、结合距离r及临界能量转移距离R0 16。 （5） （6） （7）式中，F( ) 为蛋白在波长处的荧光强度；F和F0分别表示有和无猝灭剂时蛋白的荧光强度；( ) 则为小分子配体在波长处的摩尔消光系数；J为蛋白质的荧光发射光谱与配体的吸收光谱之间的光谱重叠积分；R0是指能量转移效率 E=50% 时的临界距离；r为结合的配体与蛋白质

25、之间的距离；K2为偶极空间取向因子（取值 2 /3）；N 为介质的折射指数（取值 1. 336）； 为给体的光量子效率（取值0. 118）。由图7根据公式计算得J=3.984810-17 (cm3L/mol)，E=0.7671，R0=0.9763 nm，r=0.8004 nm。结合距离远远小于7 nm，而且结合距离符合0.5 R0 r 1.5 R0，这表明二者的结合符合能量转移理论的条件13，RBP与EGCG之间发生非辐射能量转移，并进一步证实EGCG与RBP相互作用时存在静态猝灭机制。EGCG与RBP之间的非辐射能量转移也可能是EGCG引起RBP发生荧光猝灭的原因7。同时，EGCG与RBP之

26、间较小的r值也表明两者之间较强的相互作用，说明蛋白质对EGCG小分子储存和转运比较容易15。图7 EGCG紫外吸收光谱和RBP荧光发射光谱重叠图2.3.4 EGCG与RBP结合率的预测EGCG-RBP结合率是EGCG与RBP结合的量占EGCG总浓度的百分比，它是反应EGCG与RBP相互作用的重要参数之一。当EGCG和蛋白质的结合达到动态平衡时， 根据结合常数和结合位点数接近1，可以建立EGCG与RBP结合率的理论模型。结合常数（KA）和结合率（Y）之间的关系可以通过以下公式描述13: （8）式中，Y是结合率；KA是不同温度下的结合常数；X是EGCG与RBP的浓度比；P是RBP浓度。根据实验结果

27、，运用公式（8）分别计算了不同温度下的不同浓度的EGCG的RBP结合率（图8）。由图8可知，EGCG 的RBP结合率表现出明显的浓度依赖性，EGCG与RBP结合率随着EGCG浓度的增大而减小，温度变对两者的结合率几乎不产生影响。图8中还完整描述了EGCG浓度与RBP浓度动态变化时两者之间结合率的全程规律，温度290 K、300 K、310 K时的曲线方程为： （9） （10） （11）图8 不同温度条件下EGCG与RBP的结合率因此，可以通过测定RBP和EGCG浓度，由公式（9）（11）计算其结合率，EGCG与RBP结合率可能对RBP消化性质产生影响20。3 结论采用荧光光谱和紫外-可见光谱法

28、研究了EGCG与RBP之间的相互作用，内源荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱和紫外-可见光谱均证实，EGCG与RBP之间存在较强的相互作用，形成了不发光的基态化合物，并且EGCG与RBP相互作用时，主要影响的是色氨酸残基在空间结构中所处的微环境。通过进一步对EGCG与RBP的相互作用机制进行研究，结果发现，EGCG引起的RBP荧光淬灭现象是动态猝灭和静态猝灭共同作用的结果，但以静态淬灭为主。EGCG与RBP的结合常数 KA 的数量级达到106，表明EGCG与RBP之间的结合力较强。EGCG 与RBP反应的热力学参数H和S均大于0，说明两者之间的作用力主要为疏水相互作用。同时，EGCG与RBP

29、之间存在能量转移，结合距离r非常小，也表明两者之间具有较强的相互作用。最后，本文还建立了EGCG与RBP结合率的理论模型，发现EGCG与RBP结合率随着EGCG浓度的增大而减小，温度变化对两者的结合率几乎不产生影响。但是由于RBP结构复杂，难以从更深入的分子对接层面研究EGCG与RBP的对接形态，因此，下一步将采用更多结构表征方法对EGCG-RBP复合物的结构进行全面分析。参考文献1 GUL K, YOUSUF B, SINGH A K, et al. Rice bran: nutritional values and its emerging potential for developmen

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