多药耐药基因在癫痫病人外周血表达的临床意义

1、多药耐药基因在癫痫病人外周血表达的临床意义杨美兰，陈晓燕，张允奇，黄宗清【摘要】 目的 探讨外周血多药耐受 （MDR）基因表达与难治性癫痫耐药性的关系。方式用流式细胞仪检测癫痫病人血中P-糖蛋白Pgp）的表达。结果 难治性癫痫组血清 Pgp 明显高于癫痫医治有效组和正常对照组。 结论 Pgp 在癫痫耐药的发病机制中起重要作用 , 其在外周血的高表达可作为癫痫患者耐药的一个客观指标。【关键词】难治性癫痫； P糖蛋白 ;流式细胞术Abstract ObjectiveTo explorethe relationshipbetweenthe overexpressionofmultidrugresis

2、tancegene （MDR） intheperipheralbloodofpatientswithepilepticandthedrugresistanceoftheintractableepilepsy（ IE ） .MethodsTheexpression of P- glycoprotein（Pgp） in the peripheral bloodof patientswith IE was detectedby flow cytometer（FCM）,andwas comparedwiththoseofhealthysubjectsandepilepsypatients ,which

3、 reacted well toThe level of Pgp in the serumof IE group was significantlyhigher than thoseinepilepsygroupand normalcontrolTheoverexpressionofPgp may playanimportant consideredrole in the as an objectivedrug resistance index for drugof IE, resistanceand can be in patientswith IE.Key words intractabl

4、eepilepsy;P -glycoprotein；flowcytometer难治性癫痫（ Intractable Epilepsy 简称 IE ）是神经学科研究的热点及难点之一，癫痫耐药是一个由多种因素参与的复杂进程 , 而癫痫发作呈随机性、多样性，现行的 IE 诊断 1需要经太长期的临床实践才能诊断，故极易误诊或漏诊。既往的研究要紧从病人手术切除或动物模型的脑组织着手，取材的限制严峻阻碍临床研究的开展及深切。本研究利用半定量的流式细胞仪技术检测癫痫患者外周血中 Pgp 的表达以探讨 MDR在 IE 中的作用。对象与方式病例的选择和分组 全数病例均来自 20042020 年深圳第四人民医院神

5、经内科就医的癫痫患者。病例组分为 3 组, 每组均为 16 例:（1）IE 组（ A 组） : 男 9 例，女 7 例, 年龄 1046 岁, 病史 39年，均有典型癫痫发作史及脑电图表现 , 符合 IE 诊断1，现联用两种一线 AEDs, 检测 AEDs均在正常范围 ; （2）药物医治有效组（B 组）:男女各 8 例, 年龄 1249 岁，病史 26 年，均有典型癫痫发作史及脑电图表现 , 经一线 AEDs正规医治 2年未发作 , 至少半年未发作 , 排除其他中枢神经系统疾病或占位病变； （ 3）健康对照组（ C 组） : 16名, 为本院无癫痫及其他重大疾病的健康体检者 , 均无癫痫发作史

6、，男女各 8 例, 年龄 1452 岁。要紧实验试剂及设备 购自 BeckmanCoulter 公司的 Pgp单克隆抗体 CD243-PE、IgG2a-PE、溶血素（Lysing solution ）及库尔特 Epics XL 型流式细胞仪。实验方式全数标本用流式细胞仪按以下方式 2 检测 Pgp的表达相对量 : （1）在检测管和同型对照管中加入肝素抗凝血100l 后,检测管中加入CD243-PE 20l,对照管中加入IgG2a-PE 20l, 混匀后室温下避光孵育 30min; （2）加入溶血素溶血 10min; （3）PBS洗涤 2 次; （4）用流式细胞仪以淋巴细胞设门 , 搜集 1 万

7、个白细胞, 用 CELL QUEST统计软件计算 Pgp表达阳性的细胞百分数。统计学处置采纳 SPSS软件进行统计处置 ,数据用（xs）表示,行 ANOVA分析法中的 LSD法进行查验分析，P 为不同有显著性。结果见表 1。 表 1 三组 P-糖蛋白表达的相对量注： CBZ：卡马西平；VPA：丙戊酸钠； PHT：苯妥英钠。年龄、性别、病程均无统计学不同，A 组与 B 组的 AEDs无统计学不同。 * 表示 Pgp 表达量 B、 C 组与对照组比较不同有显著性（ P ）。3讨论癫痫的耐药机制形成复杂,至今尚未完全说明。在临床实践中人们发觉若是患者对某种AEDs耐受 ,往往对其他具有不同化学结构、

8、 不同作用途径、不同作用机制的一线AEDs也不灵敏，于是人们猜想IE的耐药极可能是一种一起的、非特异性的耐药机制，即多药耐药Multidrug Resistance, MDR）机制，并提出了 IE 的耐药机制假说 -多药转运蛋白学说 （multidrug transporter hypothesis ）, 此学说以为 Pgp 的高表达可使 AEDs在癫痫病灶的浓度太低 , 从而致使耐药3 。人类 MDR基因族由 MDR一、 MDR3组成 , 研究说明细胞耐药性由MDR1起主导作用 , 其表型是分子量为 170000 的 Pgp, 由 1280 个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，含有两个由链区连接的相同

9、亚基,每一个亚基都有 6 个疏水跨膜区和一个ATP结合位点 ,是一种能量依托性外排泵。在中枢神经系统中 , Pgp普遍存在于脑毛细血管内皮细胞、脑实质的星形胶质细胞的足突 ,和大脑毛细血管质膜、蛋白质的合成、糖基化和膜转运等场所。在生理状态下Pgp可阻止外源性毒素入侵,清除内源性有毒物质 ,维持内环境的稳固，因此正常人亦可有必然的表达4 ，本研究与之相符。 当机体处于某种病理情形下 （如癫痫）, 脑内内环境的改变可致使血脑屏障完整性临时被破坏 , 现在 Pgp的表达发生转变，在毛细血管内皮细胞的表达限制了 AEDs进入脑内，从而降低脑内药物浓度，而在神经胶质细胞和神经元细胞的表达可能阻碍了细胞

10、内 AEDs的药物作用，使其耐药。由于 IE 严峻阻碍人们的生活质量， 研究者对 IE 做了大量的工作。 Brandt 等 5研究发觉对苯巴比妥耐药大鼠的海马及边缘叶 Pgp 显著高表达，加用 Pgp拮抗剂后可恢复 PB的抗癫痫作用， 以为 Pgp 的高表达参与了 IE 的形成，痫性活动可增进 MDR1基因的高表达 , 而与AEDs作用无关。也有研究 6，7以为 Pgp 高表达与癫痫发作及药物作用均有关。本研究发觉 IE 患者外周血中 Pgp表达明显高于其他两组 , 提示 MRP耐药机制中起到了重要的作用 ; 药物医治有效组 Pgp表达与健康对照组比较无统计学不同 , 提示单纯的药物诱导和癫痫

11、发作本身并非能引发外周血中 MRP1的上调 , 其上调可能是多种因素、多种机制、多途径、多环节一起作用的结果。 因此，咱们在处置 IE 患者方面应从多途径、多种作用机制的药物着手， 这也是目前新型 AEDs不断问世的作用点及冲破口。鉴于 AEDs经血入脑 , 血中有药理作用的 AEDs游离浓度与脑内起抗癫痫作用的药物浓度呈正相关关系 , 检测其外周血中 MDR表达可同步反映其脑组织中 MDR表达水平。且外周血取材方便、可重复性强，便于临床研究、指导诊治，故检测其 Pgp 表达有助于对药物或手术医治进行适时监控及指导，对 IE 的发病机制及临床研究具有极高的价值。可是由于 MDR基因具有多态性，

12、如何把握 Pgp 表达和功能与疾病易感性和特异性之间的关系和平安调剂 Pgp 功能到平安状态尚有待进一步研究。【参考文献】郭玉璞 , 王维治 . 神经病学，第 2 版. 北京 : 人民卫生出版社 , 2006，1047-1058.2 Lazarowski A , Sevlever G, Taratuto A, et al. TuberoussclerosisassociatedwithMDR1 geneexpressionanddrug-resistantepilepsy.PediatrNeurol,1999, 21（4）: 731-734.3 Bankstahl JP, Hoffmann K

13、, Bethmann K, et al. Glutamate is critically involved in seizure-induced overexpression of P-glycoprotein in the brain. Neuropharmacology,2020,546）:1006-1016.4 宋玉华，罗兵，佟琳如 .多药耐药相关蛋白基因在进行白血病中的表达 .青岛大学医学院学报， 2001,37 ：412-413.5 Brandt C, Bethmann K, Gastens AM, et transporter hypothesis of drug resistance in Proof-of-principle in a rat model of temporal lobe epilepsy.multidrugepilepsy:Neurobiol Dis,2006, 24（1）: 202-211.吴春春 , 丁成赟 , 徐群渊 , 等. 卡马西平增加癫痫模型大鼠脑内P-糖蛋白的表达 . 基础医学与临床， 2007，27: 1208-1213.7