植物激素的检测与未来展望

1、学年论文题目：植物激素的检测与未来展望学院：生命科学学院专业：生物技术班级：2008级生物技术1班学生姓名：董向艳学号：200874020108指导教师：杜捷讲师简 评短语成绩指导教师签名：植物激素检测与未来展望董向艳西北师范大学生命科学学院2008级生物技术1班摘要：植物激素是植物体内的微量信号分子，它们几乎调节着植物生长发 育的所有过程，植物激素检测常用的方法有生物试法、免疫学方法及 物理化学方法1。生物传感器由于其反应快速、灵敏度高、易于操作 和能耗低等优点在植物激素含量测定中受到了广泛的关注。概述了生 物传感器的基本原理、分类以及几种生物传感器在植物激素含量检测 中的研究进展，分析了其

2、在应用中存在的问题，并对今后的发展趋 势提出展望。关键词：植物激素检测；免疫学方法；生物试法；生物传感器1植物激素的检测方法1.1生物试法生物试法是最早检测植物激素的方法，它是依据植物激素的生理活性，通过某 些植物的组织或器官产生的特异性反应来进行检。生物试法具有简便易行的天特 点，能够反应植物激素的生理活性，还可以鉴定新的植物激素和生理活性物质， 因此至今仍然得到广发的应用。但其不足之处在于，植物体内往往存在许多激素 分子的类似物、代谢物、拮抗物或其他干扰物质，从而影响生物试法的检测结果 。此外还要尽量控制环境因子和使用的植物材料的均一性，以便是检测的结果 准确可靠。1.2免疫学方法免疫学方

3、法的基本原理是利用抗原与抗体的特异性竞争结合，以植物激素为抗 原免疫动物得到特异性的抗体，一定量的标记激素分子（Ag*）与样品中含量未 知的激素分子（Ag）在同一个反应系统中，竞争性的与一定量的特异性抗体结合， 当反应达到平衡时，可以测定出标记激素分子（抗原）存在于抗原一抗体复合物 （Ag*.Ab）和游离状态（Ag*）的比例。根据反应平衡理论知道，如果样品中 未标记的激素的含量越多，那么形成的标记复合物就越少，因此通过Ag*/Ag*.Ab 比值的测定就可以计算出样品中激素分子的含量。标记物通常采用放射性同位 素，即放射免疫测定法。也可以采用酶分子标记，即酶标免疫测定法。1.2.1传统免疫检测法

4、放射免疫分析（RIA）和酶联免疫法（ELISA）是植物激素免疫测定中最常用的两 项微量分析方法。周燮等报道了利用RIA检测技术测定ABA，该方法重复性好， 准确度好，专一性强，但运用放射性物质，对实验人员以及环境都有不良影响。 因此不久又开发了间接的ELISA法检测IAA，并对烟草愈伤组织再生植株中的IAA 从进行了测定。随着ELISA技术的发展，利用该技术运用于测定各类农作物中 植物激素在代谢中作用的实例日渐增多,并且获得稳定的结果。近期有报道运用 免疫层析技术和液相电喷雾质谱法结合的ABA检测方法，在利用样品在过免疫层 析凝胶的高专一性和灵敏度使其成为一种新型方便，高效和灵敏的分离纯化方

5、法。1.2.2新型免疫检测法近年来，湖南农业大学植物激素重点实验室与湖南大学生物传感与计量学国家 重点实验室联合研制的植物激素免疫传感器是继色谱，质谱及其联用，ELISA和 RIA后，在植物激素测定方法领域的创新与突破。免疫传感器或免疫探针主要是 利用抗原或抗体作为识别元件，通过抗体培育形成抗体一待测物结合体，由转换 器将生物、化学信号转换成电信号，通过适当的方法进行直接或间接的定量检测。 由于抗体抗原间的高选择性和亲和力，使免疫传感器具有高的灵敏度和选择性， 并能快速、准确地进行在线分析。免疫传感器根据不同转换器不同可分为:压电 免疫传感器，电流，电容型免疫传感器等。检测阻抗型传感器已经慢慢

6、得到人们 的重视，其高精确度以及多运用于小分子检测的特点是植物激素检测的发展方 向。因此免疫学方法灵敏度可达0.5 ng/mL，相比生物检测法有很大提高，而且 相应的前处理也得到简化。1.3物理化学检测法1.3.1光谱法物理化学检测法经过不断发展后已成为植物激素分析方法的主流，主要有光谱 法和色谱法两类。传统的光谱法专一性差，现已较少使用。近年出现了以荧光技 术为基础检测植物激素的新光谱法，例如利用赤霉素和硫酸反应生成三环芳烃衍 生物在紫外光下产生绿色荧光以及ABA与浓硫酸沸水中加热后产生荧光的特点 进行检测。近期薛泉宏等6时以往的赤霉素荧光测定的方法进行改进，在不影响 结果的同时简化方法，节

7、约试剂用量，虽然灵敏度提高了，但仍然存在专一性低， 多用于定性和结构鉴定研究。1.3.2色谱法气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)是具有高专一性和灵敏度的检测方法。20 世纪60年代运用到植物激素检测后，迅速发展成为现今植物激素检测的主流方 法。GC具有高灵敏度和专一性，可用于所有植物激素的分析，但前提都必须形 成易挥发的甲基化和三甲基硅烷化衍生物才可以进行Gc分析，而乙烯是唯一以 气态存在的植物激素，因而主要运用GC测定。但通过将质谱分析(Ms)与GC结合 为目前较为可靠的植物激素测定方法，Birkemeyer等基于检测多目标运用此法 检测出IAA，茉莉酸(JA)，水杨酸(SA)，AB

8、A和玉米素(zT)。除乙烯外，HPLC对各种植物激素检测，通过选用不同类型的检测器，可以获 得较为精确的结果，并且运用于新型植物激素检测以及各类农业产品，生物生长 调节剂检测当中。而现今单用HPLC检测植物激素逐渐减少，仪器联用是发展趋 势。在此基础上K.Hoyerova直等运用高效液相色谱一串连质谱法(HPLC 一 MS/MS) 分离和纯化细胞分裂素，并运用紫外检测器获得高比率具活性的细胞分裂素。Ross等应用发相高效液相色谱与串连电喷雾离子质谱法对几种不同植物种ABA 进行了检测。2利用生物传感器对植物激素的检测2.1生物传感器生物传感器又称生物电极，是在化学传感器的基础上发展起来的，它是

9、将生物 活性物质与各种固态物理传感器相结合而形成的一种检测仪器，具有灵敏度高、 选择性好、准确度高、稳定性好和进行快速在线连续监测等特点，能广泛应用于 基础研究、生物、临床化学和诊断、环境监测、食品分析、过程控制与检测等领 域。生物传感器是一类对生物物质敏感并将其含量多少转换为可检测信号的器件。 它是由固定化的生物敏感材料作识别元件（包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、 组织、核酸等生物活性物质）与适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、场效应管、 压电品体等等）及信号放大装置构成的分析工具或系统（如图1.1所示）。当待测 物质与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物将物通过各种物理、化学型 信号

10、转换器被捕捉，然后将反应的程度用离散或者连续的电信号表达出来，从而 得出被测物的浓度。生物传感器一般由敏感膜、换能器和信号处理器3部分组成如图1所示：测量或控制装置测量或控制装置敏感膜换能器 信号处理器图1，生物传感器的组成其原理是：当待测物质与生物敏感膜（含有能与目标物进行选择性作用的生物 活性组分）接触时，生物活性组分与目标物之间相互作用产生生物学反应信息。 换能器则能敏感捕捉反应信息，并将其表达为可检测的物理信号。产生的电化 学、光学、热学、压电学等响应信号，其大小与分析物含量或浓度存在定量关系, 从而实现对待检测物质的定量检测。生物传感器一般可以从3个角度来进行分类7：根据传感器输出信

11、号的产生方 式，可分为生物亲合性生物传感器和代谢性/催化性生物传感器;根据生物传感 器中生物分子识别元件上的敏感物质的属性可分为酶传感器、微生物传感器、组 织传感器、细胞传感器、免疫传感器和DNA传感器；根据生物传感器的信号获取 方式，可分为电化学生物传感器、光化学生物传感器、压电生物传感器和热传导 生物传感器。其中电化学生物传感器按测量信号不同又可分为电流型、电位型和 电导型。2.2生物传感器在植物激素测检测中的应用近年来，研究者们基于生物传感器灵敏度高、选择性好、准确度高、稳定性高 和进行快速在线连续监测等特点研制出了一些植物激素生物传感器，在植物激 素测定领域具有重要贡献。2.2.1吲哚

12、乙酸生物传感器李春香等提出了以绿豆芽叶片组织-二茂铁修饰的碳糊电极（LFMCE ）作为 植物激素吲哚乙酸传感器的研制，探讨了影响电极性能的因素，初步研究了吲 哚乙酸氧化酶处于最优活性的基本条件。试验表明，此电极在NaH2 PO4 - Na2HPO4 （ pH5. 8）缓冲溶液中对植物生长素有良好的电催化作用，氧化峰电位 约在0. 42 V左右.用循环伏安法测得的氧化峰电流变化值与吲哚乙酸浓度在8 -160 ug /mL范围内呈良好的线性关系，检测下限为4. 2 ug /mL, 相关系数为0. 9984,在样品回收率的测定中取得满意结果。李春香9等还提出了一种酶标识抗原与待测样品的竞争免疫反应定

13、量测定IAA 的方法。方法基于金基底上形成的均一、稳定、有序的巯基乙酸自组装单层膜，在 EDC、NHS活化下，能以共价方式固定抗体。待测样品IAA含量的对数值，与酶标 催化介体邻氨基酚的氧化电流的大小成反比，利用这一关系可得校正曲线。循环 伏安法探讨了底物在不条件下的反应特征，并研究了最佳试验条件，对样品IAA 的总含量进行测定。李劲10等设计了3种测定IAA的免疫传感器：（1）基于质量放大原理，采用竞 争免疫反应，设计成压电免疫传感器实现对小分子植物激素的测定，测定范围 为0. 5- 5ug /mL液相样品中的IAA。（ 2）基于微金电极表面巯基自组装设计成 测定IAA的安培免疫传感器，测定

14、范围为5. 68 * 10- 7 - 2. 83* 10-6 mo l/L,这 种传感器能测定绿豆芽提出液中的IAA的浓度（3 ）以褐藻酸钠对硅溶胶-凝胶 碳糊电极改性，提高了电极表面的负电性，通过静电吸附进行电极表面的免疫 组装，以HRP标记的抗原为识别抗原、以H2O2 -TMB为酶联安培测定的反应底物， 设计成功基于褐藻酸钠-硅溶胶-凝胶碳糊电极（SACE）表面静电吸附免疫自组 装的安培免疫传感器，用于测定IAA的含量，测定范围为5 - 500 ug /mL。李雨薇uh等研制出基于碳纳米管和铁氤酸竦修饰纳米颗粒协同作用的吲哚乙 酸传感器，检测下限为0. 08 ug /mL。其原理是：利用铁

15、氤酸盐的良好电子转移 能力与氧化催化能力和碳纳米管的力学性能与高导电率，将铁氤酸竦纳米颗粒 与碳纳米管混合后所形成的复合材料修饰玻碳电极。IAA毗咯环上的氮原子在特 定条件下被氧化，并发生电子转移。新复合膜体现了铁氤酸盐和碳纳米管之间的 协同作用，由于碳纳米管良好的电子传递性能，使铁氤酸盐催化氧化还原能力 有较大的提高，因而可以检测微弱的电流变化。2.2.2脱落酸生物传感器李雨薇W等研制出基于电聚合纳米金修饰膜构建的脱落酸阻抗型免疫传感器, 检测下限达到0.1ng/mL。其原理是通过在氯金酸中电沉积纳米金于玻碳电极表面, 所形成的多孔纳米金修饰层直接吸附ABA抗体，使其固定于电极表面，再用牛

16、血清白蛋白封闭电极表面多余的蛋白质结合位点，当待测液中的ABA与免疫电 极表面的ABA抗体结合后将导致电极表面电子传递受阻，表现为阻抗的增加。此 传感器无须对抗原或抗体进行任何标记，可以直接通过阻抗变化值检测ABA浓 度，这种直接阻抗检测方法降低了外界对检测的干扰。Li等提出了一种基于纳米金/硫堇修饰金电极的ABA安培免疫传感器。该传感 器基于H2O2 HRP硫堇催化波体系构建，其中硫堇为传感介质。当HRP存在时， 通过加入H2O2,硫堇的还原电流大幅增加，并且电流的增加依赖于HRP活性。HRP 活性又由ABA 与HRP酶标抗体结合物调控，产生一个减小的催化波。用BSA封闭 硫堇单分子层修饰后

17、可能存在的活性位点以避免非特异性吸附。检测下限达到 0.2ng/mL。2.2.3赤霉酸生物传感器李劲等基于铜离子标记抗原，采用方波溶出伏安法设计成功测定赤霉酸的电 化学生物传感器，测定范围为1- 150ug/mL。2.2.4异戊烯基腺嘌吟免疫传感器李劲等基于电聚合膜修饰，采用双酶催化，设计成功测定异戊烯基腺嘌吟的安培免疫传感器，其测定范同为5-300ug/mL3生物传感器对植物激素检测的展望生物传感器还存在一定的局限性，比如电化学生物传感器常受到电活性物质 的干扰；压电生物传感器需要对其晶体进行校准，当用抗原/抗体包被时存在波 动现象。还有很多重要的问题如使用寿命、长期的稳定性、可靠性、批量生

18、产工 艺等都是生物传感器研究、应用和产业化亟待解决的M。但是针对植物激素这样 一种极其不稳定的物质，相比以往各种传统方法，应用生物传感器测定植物激 素含量，不但精确、高灵敏，而且具有操作简单、快速、廉价、轻巧等优点因 而是一种具有发展前景的植物激素测定方法13,14。近年来，随着纳米技术的迅速发展出现了光学纳米传感器、化学纳米传感器和生 物纳米传感器等多种纳米传感器；微型化生物传感器是一种敏感部尺寸为数微 米到数纳米的生物传感器，是近年来生物传感技术领域迅速发展起来的一类新 型传感器15。其特点是：体积小、分辨率高、响应时间短、所需样品量少、对活 细胞损伤小，可进行动态的微创测量；此外，生物传

19、感芯片在生物分析领域也 得到越来越广泛的应用。基于这些领域的迅速发展，除了继续应用成熟的生物传 感技术来探索更好的植物激素测定方法，可以预见，未来应用这些生物纳米传 感器、微型化生物传感器以及生物传感芯片等来构建微型化植物激素生物传感器， 实现对植物激素的原位、实时测定可能成为植物激素领域新的发展目标Ml 参考文献1 许智宏，李家洋.中国植物激素研究：过去、现在和未来.植物学通报，2006, 23 ( 5) : 433442.2陈宜张，林其谁.生命科学中的单分子行为及细胞内实时检测M.北京:科学出版社，2005: 111. :3何瑞，曹玉广.植物生长调节剂使用中的安全问题.中国卫生监督杂志，2003，10( 2) : 99101.:4 袁敏，张铭光,李菊白.植物生长激素的毛细管胶束电动色谱法分离.色谱，1997, 15 ( 6) : 482485. 5 张能刚，徐义俊,脱落酸间接酶联免疫检测法的建立.南京农业大学学报，1991，14( 3 ) : 21 24. :6 印莉萍，上官宇，许越.非损伤性扫描离子选择电极技术及其在高等植物研究中的应用.自然科学 进展，2006, 16( 3 ): 262 266.:7王建龙，张悦，施汉昌，等.生物传感