甘薯糖蛋白的分离纯化课件

1、甘薯糖蛋白的分离纯化微生物09301班 第七小组程蒙 董雨 叶雷 崔德1糖蛋白的介绍2 甘薯糖蛋白的分离纯化及鉴定34内容结果分析及结论小结1908年美国生物化学家协会的蛋白质命名委员会首次将糖蛋白定义为:由蛋白质分子和除核酸外的包含有碳水化合物基团的物质共同组成的一类复合物。现已将蛋白聚糖从糖蛋白中划分出来，而专指由比较短且往往具分支的寡糖链与蛋白质(多肽链)共价相连而构成的糖复合物。一，糖蛋白的介绍甘薯糖蛋白SPG-1是一具O-型糖肽键的糖蛋白，所以其中的糖链SPG小P可在碱性条件下释放，所释放的糖链能被NaBH4场还原成对碱稳定的糖醇，而SPG-1中的蛋白质(肽链)也可部份被碱性降解为低

2、聚肽和氨基酸其糖链也有可能被部分降解为低聚糖和单糖。SPG-1-P的一级结构是一种由葡萄糖形成的均多糖，为中性多糖。SPG-1-P主要是以-型糖苷键连接的，糖环为毗喃型。甲基化反应证明SPG-1-P是以-1，6-连接的葡聚糖。 糖链结构甘薯糖蛋白日本营养学家发现,甘薯含有丰富的粘液蛋白,这是一种多糖与蛋白质结合的糖蛋白,对人体有特殊的保护作用,能保持消化道、呼吸道、关节腔、膜腔的润滑和血管的弹性,由于这种物质可防止脂类物质在动脉管壁上沉积而引起的动脉硬化,防止肝及肾脏等器官结缔组织的萎缩,可以减缓人体器官的老化,提高肌体免疫力。日本国力癌症预防研究所通过实验证明,甘薯的抗癌效果在各种蔬菜中位居

3、第1。我国是世界上甘薯生产第1大国,在甘薯淀粉生产过程中会产生大量的废液，这其中就含有大量的甘薯糖蛋白。甘薯糖蛋白的利用（）国外甘薯食品的开发利用现状目前，国外的甘薯食品有：方便食品、快餐食品、方便半成品，如薯米(粒)、薯粉、薯面、脱水薯片(条、泥)；休闲食品，如膨化薯片、薯脯等，这类食品具有味美、食用方便、包装精美等特点；其他，如甘薯饮料、甘薯罐头、甘薯酒等i引。近年来，国外一些地区掀起了一阵甘薯食品热，一些较大的食品厂竟相丌发甘薯食品，使这种普通的甘薯成为人们喜好的新潮食品。目前它己被制作成山芋饼、小甜饼、果子冻、冰淇淋、果子露，甘薯酸奶等多种保健食品和美容食品。（）国内甘薯食品的开发利用

4、现状国内利用甘薯加工的食品有：甘薯脯、甘薯蜜饯、甘薯酱、薯糕、软糖、罐头、粉丝、粉条、粉皮、甘薯粉、多维面条、煎饼、雪糕、巧克力、膨化食品、脱水甘薯片、虾味脆片、速煮甘薯、冷冻甘薯片、连城红心薯干、香酥薯片、甘薯发糕、甘薯点心、甘薯黄酒掣。目前，香港己流行用甘薯叶制作名宴菜，菜市出售每kg甘薯叶价超过100港元，且货源奇缺，经常脱销。用甘薯叶加工成的脱水菜、盐渍菜，在日本、欧美、东南亚等地市场非常畅销。我国福建省的永定、新罗、安溪、永春等地及广东省一些地区，也常以甘薯叶作为夏季蔬菜。甘薯叶食用方法简单，取幼嫩的叶片与叶柄(撕去表皮)，经开水烫熟后，佐以香油等调料即可入肴，也可加调料爆炒。仪器：

5、紫外可见分光光度计、SDS-PACE电泳仪、自动部分收集器、冷冻真空干燥器、离心机、层析系统、ZK-82A真空干燥箱2.甘薯粗糖蛋白提取的工艺路线为： 甘薯粉一热水浸提一抽滤得到浸提液一浸提液真空浓缩一醇析过夜一离心弃上清一少量水溶解一Sevag法去除游离蛋白一离心一取水层透析一透析内液醇析过夜一离心一沉淀真空干燥一甘薯粗糖蛋白，3.分离和纯化的操作步骤 (1)称取的甘薯在60下烘干并粉碎，加适量（46倍）水浸取3次，每次0.51h。 (2)合并浸取液，离心，上清液加无水乙醇沉淀蛋白，离心后分离出沉淀。 (3)所得沉淀物用适量蒸馏水溶解，再加入氯仿：正丁醇=4:1(V/V）的Sevag试剂，以

6、充分去除脂质、游离蛋白质，然后样液取水层透析，收集透析袋内液，离心（4500r/min）30min，取上清液，真空干燥后即得甘薯糖蛋白粗品（淡黄色粉末）(4)甘薯糖蛋白粗品依次经DEAE - 纤维素52柱层析(1.6cmx20cm)，分别用0.05,0.1,0.5mol/L的碳酸氢钠溶液分阶段洗脱，收集洗脱液。(5)洗脱液在经过Sephadex G-100柱层析(1.6cmx80cm),用0.02mol/LTris-HCL(pH7.2)洗脱，收集洗脱液X(2) SDS一聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳对甘薯糖蛋白的纯度鉴定甘薯糖蛋白粗品和经DEAE-52柱层析、Sephadex G-100

7、柱层析后的甘薯糖蛋白纯品同时进行SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳，分离胶浓度为15，浓缩胶浓度为6，电极缓冲液为pH83的TrisGlySDS溶液，用考马斯亮兰R250染色，脱色液为7冰乙酸。实验发现如图、图，甘薯糖蛋白粗品经电泳后，有两条染色带，而甘薯糖蛋白纯品只有唯一的一条带，可以证明甘薯糖蛋白纯品已经得到纯化。图甘薯糖蛋白粗品图甘薯糖蛋白纯品SDSPAGE电泳图SDSPAGE电泳图三、结果分析及结论甘薯糖蛋白提取料液比及时间的确定甘薯糖蛋白提取沉淀试剂的选择透析对甘薯糖蛋白提取率的影响甘薯糖蛋白的纯化结论从图可以看出，随溶剂体积的增加和提取时间的延长，提取率逐渐增大。当提取溶剂大于6倍样品体积

8、和提取时间大于lh后，提取率基本不变。故选择溶剂为6倍样品体积，提取时间lh为最佳提取条件。甘薯糖蛋白提取料液比及时间的确定甘薯糖蛋白提取沉淀试剂的选择从图可以看出，三种溶剂中，丙酮的沉淀作用最强1030乙醇、甲醇对甘薯糖蛋白没有沉淀作用，但三种溶剂在90时达到相同的沉淀效果。考虑到生产成本，本实验选择无水乙醇为沉淀甘薯糖蛋白的溶剂透析对甘薯糖蛋白提取率的影响通过透析，分子量小于1000Da的小分子物质被去掉。在透析过程中，观察到透析袋内样品颜色变淡，而透析袋外液由无色转为淡黄色。从图可以看出，通过72h透析，估计原样品中近50的杂质被透析除去，经检验，已有效除去还原糖、氨基酸等小分子组分。将

9、透析袋内液真空干燥得淡黄色粉未即为甘薯糖蛋白粗品，可供柱层析纯化。甘薯糖蛋白的纯化用00507m01L的碳酸氢钠溶液洗脱时，如表l，既改变了洗脱液的pH，又改变了离子强度，甘薯糖蛋白得到较好的分离。尤其在分段洗脱阶段，当碳酸氢钠溶液浓度为005、01、05molL时，A490和A280值均较高，故O05、01、05molL的碳酸氢钠可作为DEAE一52柱层析纯化甘薯糖蛋白的适宜阶段洗脱剂甘薯糖蛋白的纯化DEAE52柱层析纯化甘薯糖蛋白效果从图4可以看出，在DEAE52纤维素层析柱上，甘薯糖蛋白粗品经005、01、05mol/L的碳酸氢钠溶液阶段洗脱，得到1个洗脱峰，取此高峰部分透析干燥，得白色

10、粉末。 结论本文提出的室温下水浸提，无水乙醇沉淀，sevag试剂脱蛋白、透析后经DEAE一52柱层析、SephadexC100柱层析分离纯化甘薯糖蛋白的流程，得到纯度很高的甘薯糖蛋白。该流程能有效地纯化甘薯糖蛋白，具有产物纯度高、方法简便、收率高等优点，为我国资源丰富的甘薯找到了一条深加工途径，另外为不同加工品种的选择提供了依据。四小结，用有机溶剂乙醇沉淀法：具有沉淀作用强，沸点适中，无毒的优点丙酮：介电常数小于乙醇，沉淀的能力较强，但沸点较低，挥发损失大，对肝脏有一定的毒性，着火点底。然而在操作过程中对温度等蛋白质沉淀的影响要求高，也要防止甘薯蛋白质变性用法（氯仿：正丁醇:）来除去脂质。游离蛋白质等杂质参考文献【】孙册，莫汉庆糖蛋白与蛋白聚糖结构、功能和代谢M北京：科学出版社，1998【】张维杰复合多糖生化研究技术M上海：上海科学技术出版社，1987【】田庚元，王晨，冯宇澄枸杞子糖蛋白分离纯化、物化性质及糖肽键特征J生物化学与生物物理学报，1995，27(2)：20l一206【】王翎虫花菌胞外糖蛋白的分离、纯化及其性质研究J真菌学报，1996，15(