王镜岩-生物化学I-第7章 蛋白质的分离纯化和表征-第8章 酶通论课件

1、Protein第7章 蛋白质的分离纯化和表征 蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大pI 越大pI通常在 6.0 左右一、蛋白质的两性电离及等电点 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿1C12绝对质量/12 1.6610-27千克二、蛋白质分子的大小（一）根据化学组成测定最小分子量1、测定蛋白质中某一微量元素的含量2、假设蛋白质中仅含一个铁原子最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量（二）SDSPAGE测定相对分子质量蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于：所带电荷分子量分子形状十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基 极性亲水烷基 亲油（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状

2、无关，仅取决于相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键（三）凝胶过滤法测定相对分子质量蛋白质混合样凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.水膜弹性蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质（二）蛋白质的沉淀 Pr从胶体溶液中析出 可逆沉淀：温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷Pr结构和性质没有变化适当条件下可重新溶解 非变性沉淀pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 1.盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解盐溶原因？盐溶盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后

3、破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中盐溶盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析（NH4）2SO4）2.有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用3.等电点沉淀4.重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐5.生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐6.加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态四、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活1.前处理：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以

4、及亲和层析等4.结晶血液透析小分子溶出小分子被带出透析机透析液加压血液2、密度梯度（区带）离心6000080000转/分重力60万80万倍（二）利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析3.有机溶剂分级分离法降低介电常数争夺水化膜（三)根据电荷不同的分离方法电泳原理：蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0分子大小不同，电场中移动速度也不同等电聚焦电泳双向电泳离子交换层析（四）利用蛋白质选择性吸附的性质羟磷石灰层析疏水作用层析（五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒具有极强的专一性六、蛋白质含量测定和纯度鉴定（略）第8章

5、酶通论Enzyme酶的发现及研究历史人们对酶的认识起源于生产与生活实践。夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。酶者，酒母也酵素的发现 enzyme (in yeast)enzyme是希腊文 en = in ， zyme = yeast什么是酶？酶是生物催化剂生物体一切生化反应都需酶催化才能进行！性能远远超过人造催化剂定义：由活细胞产生的、 有高度专一性和 高效催化作用的生物大分子。一、酶催化作用的特点 1. 提高反应速度，不改变平衡点; 2. 只起催化作用，本身不消耗； 3. 降低反应的活化能。 （一）与一般催化

6、剂相同的特点 活化能(activation energy) 指在一定温度下，1mol底物全部进入活化态所需要的自由能 单位：KJ/mol酶催化反应的实质：降低反应的活化能1. 易失活（温和性）（二） 生物催化剂的特点常温、常压、中性 除个别RNA为催化自身反应的酶外，其余所有的酶都是蛋白质。2. 高效性且无副反应反应速度是无酶催化/普通人造催化剂催化反应速度的1061016倍。 酶的催化双氧水裂解3.专一性Specificity: 酶对催化的反应和反应物有 严格的选择性。底物（Substrate): 酶作用的物质。 （1）酶浓度的可调性 （2）通过激素调节酶活性 （3）反馈抑制调节酶活性 （4

7、）抑制剂和激活剂 （5）别构调控、共价修饰、同工酶等 4. 可调节性二、酶的化学本质及分类经酸碱水解终产物是AA能被蛋白酶水解而失活酶可变性失活酶是两性电解质具有不能通过半透膜等胶体性质具有蛋白质的化学呈色反应化学本质是蛋白质（一）酶的化学本质1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNAribozyme（核酶），以后又陆续发现了真正的RNA催化剂。 单纯酶 ：只有蛋白质 结合酶（缀合酶）：脱辅酶 + 辅助因子辅助因子辅基辅酶与酶结合紧与酶结合松全酶（二）酶的化学组成羧肽酶NADPH脱氢酶的辅酶过氧化氢酶结合酶中： 单独酶蛋白或辅助因子没有催化活性一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合同

8、种辅助因子可与不同的酶蛋白结合 酶蛋白：决定反应的专一性辅助因子：传递电子、原子或某些 化学基团的作用monomeric enzyme：一般由一条肽链组成oligomeric enzyme：为寡聚蛋白，2个亚基multienzyme complex：几种酶靠非共价键 彼此嵌合而成。由数个独立的酶组合起来形成络合体，催化一系列反应。（如糖代谢、脂代谢）（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体根据酶蛋白分子的特点：三、酶的命名和分类（一）习惯命名法根据其催化底物来命名；根据所催化反应的性质来命名；结合上述两个原则来命名，有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。优点 命名简单应用历史较长，使用方便缺点一

9、名数酶、一酶数名为了适应酶学发展的新情况，国际酶学会议于1961年提出一个新的系统命名法及分类原则，已被国际生化协会采用。（二）国际系统命名法：系统名称包括底物名称、反应性质，最后加一个酶字。 底物1 ：底物2 + 反应性质+酶 乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸：NAD+氧化还原酶当底物为水时，可省略 系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸：NAD+氧化还原酶 惯用名：只取较重要的底物名称和反应类型。乳酸：NAD+氧化还原酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。（三）国际系统分类编号 1961年国际酶

10、学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：氧化-还原酶催化氧化-还原反应，催化氢的转移或电子传递。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。1、氧化还原酶 OxidoreductaseAH2 + B（O2）A + BH2（H2O2，H2O）（四）六大类酶的特征（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应AH2 +BA +BH2（需辅酶或辅酶）（2）氧化酶类催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2 + O2A + H2O2（需FAD或FMN）催化底物脱氢，氧化生成

11、H2O：2AH2 + O22A + 2H2O（3）过氧化物酶ROO + H2O2RO + H2O + O2（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2 +OHOHC=OC=OOHOH（顺，顺-已二烯二酸）RH + O2 + 还原型辅助因子ROH + H2O + 氧化型辅助因子（又称羟化酶）转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。根据X分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。2、转移酶 TransferaseAX + BA +BX水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂

12、酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：3、水解酶 hydrolaseAB + H2OAOH + BH裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。4、裂合酶 Lyase异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应5、异构酶 IsomeraseABPP合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸6、合

13、成酶 Ligase or SynthetaseA + B + ATPAB + ADP +Pi酶的系统编号：4位数字第一位：代表六大类反应类型第二位：亚类（作用的基团或键的特点）第三位：亚亚类（精确表示底物/产物的性质）第四位：在亚亚类中的序号乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的编号指酶对底物的选择性，也称特异性。结构专一性立体异构专一性绝对专一性相对专一性族专一性键专一性旋光异构专一性几何异构专一性四、酶的专一性（一）酶的专一性（1）锁钥学说刚性构象（2）诱导契合学说（3）结构性质互补学说 静电效应、

14、极性相同（4）三点附着学说 立体异构专一性的酶（二）与酶专一性有关的学说锁钥学说认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样诱导契合学说酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状. （Koshland，1958）：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置，有利于催化。羧肽酶的诱导契合模式“三点结合”的催化理论酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。（一） 酶活力与酶促反应速度 酶活力就是

15、酶催化反应的能力 能催化多快的反应 通常以测出的酶促反应速度表示 五、酶的活力测定和分离纯化单位时间内底物的减少或产物的增加1. 酶促反应速度的测定方法产物浓度变化曲线用哪一个速度来表示酶促反应的速度特征呢？反应初速度 Vo反应初速度表示酶活力2.活力单位 (U) 酶单位（U）： 在一定条件下、一定时间内、将一定量的 底物转化为产物所需的酶量。如： 每小时催化1克底物 每小时催化1ml某浓度溶液 每分钟催化1ug底物一定时间一定量底物一定条件下 在标准条件下（25 ，最适pH和最适底物浓度）一分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。 1 IU= 1 mol / min 酶活力单位标准化（1

16、）国际单位（IU） 在标准条件下（25 ，最适pH和最适底物浓度）每秒钟催化1摩尔底物转化为产物所需的酶量。 1 Kat =1 mol/s = 60106 IU酶活力单位标准化（2）Kat每mg酶蛋白所含的酶活力单位数。 u/mg酶蛋白酶产品质量评价中常使用，一定程度上代表酶的纯度。（3）比活力 (specific activity)一定条件下：每秒钟、每个酶分子转换的底物分子数或每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数一秒内1摩尔的酶可催化几摩尔的底物 （4）转换数（turnover number）酶活力测定实例确定反应条件 20、pH=7，底物浓度 6g/l（过量）， 加入2mg固体脂肪酶确定活力

17、单位 每小时催化1克底物 1u= 1g/h 测反应初速度 作产物甘油随时间增加的曲线， 量出反应初速度值 ， 换算为脂肪的消耗速度。如 8g/h换算活力 8g/h / 1g/h=8u计算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白脂肪脂肪酶甘油 + 脂肪酸 测定完成一定反应所需的时间 测定单位时间内酶催化的化学反应量（1）分光光度法： 利用底物/产物光吸收性质不同 选择适当波长来测定。（2）荧光法： 利用底物/产物荧光性质的差别。紫外/可见光3. 酶活力的测定方法（3）同位素测定方法： 放射性同位素标记底物， 经酶作用得到相应产物， 经适当分离，测定产物脉冲数即可。（4）电化学法： 包括pH测定

18、法，离子选择电极法等。 前者跟踪反应过程中H+的变化， 后者用氧电极测定一些耗氧的酶反应。（二）酶的分离和纯化衡量分离提纯效果的两个指标：总活力的回收是表示提纯过程中酶的损失情况比活力提高的倍数是表示提纯方法的有效程度分离纯化方法同蛋白质纯化类似：1.选材：酶含量丰富的新鲜生物材料2.破碎：因材料而异3.抽提：低温下以水或低盐缓冲液抽提4.分离及纯化：粗分级，细分级分离5. 结晶6.保存：低温下酶粉可长期保存注意低浓度酶溶液易变性酶的制备过程中，每步都应进行鉴定常用的鉴定指标为：回收率每次总活力100 /第一次总活力纯化倍数=每次比活力/第一次比活力 产率酶的纯度鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法等电

19、聚焦电泳法六、核酶（ribozyme)（一）核酶：具有催化活性的RNA (1) 1982年，Cech首先发现四膜虫 L19RNA既有RNA酶活性，又有 RNA聚合酶活性。 随后的研究表明： L19RNA具备酶促催化的几个特征： 高度的底物专一性 遵循Michaelis-Menten动力学 对竞争性抑制剂的敏感性 (2) 1992年，Piccirilli等发现L19RNA具有氨酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。 (3) L19RNA还有限制性内切酶作用： -CpUpCpUpN- + G -CpUpCpU +GpN (4) 1997年，Zhang和Cech用人造的RNA分子催化合成了肽链，表明RNA具

20、有肽基转移酶活性。 (5) 原核生物RNaseP和 兔肌1，4- -葡聚糖分枝酶均包括RNA+蛋白组分，起催化作用的都是RNA。（二）核酶的种类（自我催化） 自我剪切： 是转录后加工方式之一 （self- cleavage） 自我剪接 （self-splicing） 需要鸟苷和Mg2+参与不需要鸟苷的参与剪切与连接催化分子内反应核酶的典型结构特点： 三个螺旋 13个保守碱基 剪切点：GUN RNA既能携带遗传信息 又有生物催化功能。RNA可能早于蛋白质和DNA， 是生命起源中首先出现的生物大分子 切割癌基因、致病病毒基因（三）核酶的研究意义与应用前景是具有催化作用的抗体本质是免疫球蛋白 在易变区被赋予酶的属性， 又被称为催化性抗体。基态底物过渡态底物七、抗体酶（abzyme)第一代抗体酶 （过渡态底物的抗体） 1986年，Schultz与Lerner同时得到了具有催化活性的抗体； 第二代抗体酶 （引入法） 将催化基团及辅助因子引入到抗原抗体结合部位。第三代抗体酶 （拷贝法） 酶 抗体 抗抗体酶工程：酶制剂在工业上的大规模生产及应用。 普通酶工程、化学酶工程、生物酶工程普通酶工程 单纯生物提取化学酶工程1、微生物发酵得到粗酶2、对天然酶进行化学修饰、固定化处理， 利用化学合成等手段来改善酶