分子生物学第11章转录前的基因活化课件

1、11.1 DNA水平的调控11.2 染色质结构与基因活化11.3 核基质附着区与基因表达11.4 DNA甲基化在调节基因表达中的作用11 转录前的基因活化基因表达调控的层次 基因表达受发育阶段及环境因素的影响。生物体对基因表达的调控有许多的层次，如转录前的基因活化、转录过程、转录后的RNA加工成熟过程、翻译过程、翻译后的多肽加工过程。这些过程对于生物生长发育是非常重要的。 DNA 水平的调控 某些原生动物、线虫和甲壳类动物在个体发育中，体细胞会发生染色体丢失现象，只有将来分化形成生殖细胞的那些细胞才保持完整的基因组。 目前在高等真核生物（包括动、植物）中尚未发现类似的基因丢失现象。 基因丢失基

2、因丢失 马蛔虫受精卵里只有一对染色体（2n = 2），当个体发育到一定阶段后，在将分化为体细胞的那些细胞中，这对染色体破碎成许多小染色体。有的小染色体具有着丝粒，在细胞分裂中得到保留，不具有着丝粒的小染色体因为在以后的细胞分裂中不能分配到下一代细胞中而丢失，在将形成生殖细胞的那些细胞里却没有染色体破碎和丢失现象。这些基因的丢失决定了细胞的命运。 基因丢失（续） 许多原生动物细胞中（纤毛虫纲的草履虫、钟虫等）含有两种类型的核，小核和大核。通常在它们的生殖细胞中只具有一个小核，当细胞分化时，小核经历各种变化，最终结果是产生拥有一个大核和一个小核的双核细胞。小核中含有无活性的DNA，仅仅为将来产生生

3、殖细胞贮藏遗传信息；大核中的DNA则是具有转录活性的模板。 DNA 水平的调控 基因扩增 基因扩增是指细胞内某些特定基因的拷贝数专一性地大量增加的现象，它是通过改变基因的数量而调节基因表达的一种调控方式。当发育分化或环境条件改变，使对某种基因产物的需要量剧增，单靠调节表达活性不足以满足需要时，依靠基因扩增可迅速增加基因表达产物的量。 基因扩增（续） 在两栖类和昆虫的卵母细胞中，为贮备大量核糖体以供胚胎早期发育的需要，通常专一性地扩增rRNA基因。非洲爪蟾体细胞rDNA拷贝数约500个，而卵母细胞中rDNA的拷贝数可达2百万个，以染色体外环状DNA分子的形式存在，每个环状DNA分子含24个甚至多

4、达16个rRNA基因。这些rDNA约占整个卵母细胞DNA的75%。当胚胎期开始时，这些染色体外扩增的环状rDNA拷贝即失去功能并逐渐消失。 基因扩增（续） 稳定系中扩增的 dhfr 基因成簇串联在一起，位于一条染色体原来的 dhfr 基因位置上，而其同源染色体的 dhfr 基因通常不扩增。不稳定系中扩增的 dhfr 基因以双小染色体（double-minute chromosomes）的形式存在，每个双小染色体含有24个 dhfr 基因，双小染色体可以自主复制，但无着丝点，在有丝分裂中不能均等地分配到子细胞中去，并常常因此而丢失。DNA 水平的调控基因重排 基因重排是改变基因组中有关基因序列结

5、构的一种基因表达调控方式。一个最典型的例子是人和哺乳动物在B淋巴细胞分化期间发生基因组重建，从而产生抗体的多样性，以识别和区分不同结构的抗原。 基因重排 抗体分子中最主要的IgG是由两条轻链和两条重链组成。轻链和重链由3个独立的多基因家族编码，其中两个编码轻链（和），一个编码重链。基因重排 小鼠的重链和链基因族各有V片段约200个，链的V片段有5个；J片段有5个；D片段有12个。人的抗体基因族结构大体相似，但分布在不同染色体上。当淋巴细胞受到抗原刺激而分化为浆细胞时，胚原型DNA将发生基因重排而形成表达型DNA。重链取一个V、D、J与L、C重排成表达型DNA，而将其它的V、D、J切除；同样轻链

6、也取一个V、J与L、C重排。这样每一种淋巴细胞能且仅能产生一种抗体。 鼠胚系Ig基因的构成小鼠Ig重链的基因重排、转录与合成的顺序小鼠Ig重链的基因重排、转录与合成的顺序（续）小鼠Ig轻链的基因重排、转录与合成的顺序小鼠Ig重链的基因重排、转录与合成的顺序（续）图111 真核生物染色体的组装模式常染色质和异染色质 常染色质是间期核内凝缩程度相对较低的染色质区，异染色质是凝缩程度相对较高的染色质区。按其功能来分，根据其是否转录区域，还可以将染色质分为活性染色质和非活性染色质，异染色质中都是非活性染色质。常染色质中一部分是活性染色质，一部分是非活性染色质。活性染色质伸展成念珠状，有些地方还与组蛋白

7、分离。 常染色质，示活性染色质和非活性染色质及DNase超敏感位点非活性染色质活性染色质极低浓度DNase能够切割的位点称为DNase超敏感位点。成串的非甲基化的CpG序列称为CpG岛H1组蛋白的修饰 H1组蛋白结合在核小体DNA进出口处，并在形成二级结构30nm螺线管时起重要作用。当在H1组蛋白特异的氨基酸残基上发生磷酸化时，染色质凝缩，使该区域成为异染色质。关闭该区段的基因表达。 非组蛋白修饰 非组蛋白中包括各种转录因子（反式作用因子），它们的活性也会受到修饰调节。在非组蛋白中有一类，由于其在电泳中的高迁移率，故称为高迁移率蛋白（high mobility group, HMG），它们常与

8、活性染色质结合，并与转录效率升高相联系。 核基质 染色质可用盐、中性去垢剂和Dnase等化学方法和电泳等物理方法来提取。提取后残留的结构，即为核基质（nuclear matrix），也称核骨架（nuclear scaffold）。核基质的主要成分是蛋白质。 间期染色质提取后残留的核基质是一种有着不同密度的纤维状网。 基质附着区 真核生物的染色体是由周期性紧密结合在核基质上的DNA环组成的。DNA上与核基质结合的那段序列称为基质附着区（matrix attachment regions，MARs），或称为基质结合区（matrix association regions，MARs）。MARs之间的

9、环约为5200kb左右。如果以间期染色质平均85kb有一个环来计算，具有109核苷酸对的二倍体细胞应有23,000个MARs。 基质附着区（续） 现有的研究表明，MARs序列缺少保守性，它们通常含有约 70% 的 A + T ，除此之外缺少共有序列。不同来源的MARs之间不能相互杂交，但可以与不同来源的核基质结合，说明其序列同源性虽差，但在功能进化上却是保守的。图113 MAR与核基质的相互作用图114 活体或离体两种方法检测MAR（1）与核基质结合活体方法离体方法图114 活体或离体两种方法检测MAR（2） 提取的DNA跑两个泳道，用特异的DNA探针检测其中一个泳道，看是否有特异的MAR片段

10、活体方法离体方法 MARs在基因表达中的作用 MARs在基因表达中可能有4种作用： 边界元件作用，它确定了独立的基因调节区域。 染色质调节作用，MARs作为刺激或阻遏基因表 达的顺式作用元件，可促进调节蛋白的结合和 作用。 作为DNA复制起点的组成起作用。 对于有丝分裂中期染色体的组装并保持一定形状 是重要的。 图117 侧向构建有MAR的转基因形成独立活性结构区MARs的边界作用 图116 基质附着区（MARs）功能分析1kb DNA云扁豆蛋白基因增强子不能促进表达增强子激活了表达MARs的边界作用 MARs 的调节作用 当用一个异源的酵母ARS1 MAR作为侧翼的GUS（葡糖苷酸酶）报告基

11、因转入烟草细胞，使报告基因的表达水平提高了12倍，最高达24倍。而改用来自烟草内源的与核基质结合较强的R67 MAR替换上述与核基质结合较弱的酵母ARS1 MAR时，GUS的表达水平提高了60倍，最高达140倍。这说明与核基质结合力较强的MAR比结合力较弱的MAR对基因表达的影响较大。 MARs 的调节作用（续） 在对番茄热激蛋白基因表达的研究中发现，只有在3MAR、5MAR及内含子均存在的情况下基因正常表达，缺少其中一个将大大降低基因表达。这说明基因侧翼的MARs和内含子对于基因表达的调控有关。 DNA甲基化 在真核生物DNA中，甲基化发生在胞苷酸残基胞嘧啶环的5位碳原子上。甲基化位点通常在

12、CG序列上。对于植物来说，甲基化还能在CNG序列的C上发生。 CG CNG GC GNC 在上述序列中，如果一个位点上只有一条链的C被甲基化，称为半甲基化；如果一个位点两条链的C都被甲基化，称为完全甲基化。 一般认为，高度甲基化的区域是不转录区域。 DNA甲基化的作用 甲基化能防止相关限制酶的切割作用，还能阻碍调节蛋白与之结合，在基因启动子和编码区的甲基化可能抑制转录。 植物DNA甲基化主要存在于核基因组。 限制性内切酶对甲基化和非甲基化CCGG的切割 图119 DNA复制时甲基化类型的传递不对称序列的甲基化，新合成的子链不甲基化。 DNA甲基化与基因表达 高度甲基化基因的表达受到抑制。由于不

13、同的基因在不同的器官或不同的发育阶段表达，其甲基化状况也发生相应的变化。如雌性哺乳动物的一条X染色体高度甲基化，而以非活性状态存在；珠蛋白基因在红细胞中是低甲基化的，而在不表达珠蛋白的其他细胞中则高度甲基化；管家（看家、持家）基因（housekeeping gene）是持续表达的，其转录起始区很少发生甲基化。实验表明，低甲基化区域与DNase超敏感区域是十分吻合的。 甲基化对基因表达的影响机理 甲基化对基因表达的影响机理可能与反式作用因子与DNA的结合有关。有些蛋白可以与甲基化的CpG位点结合，起到阻遏蛋白的作用；有些转录因子不能与甲基化的CpG位点结合，甲基化后转录不能进行。一些看家基因的启动子区常富含CpG岛，所以可以保持转录。 图1111 看家基因的CpG岛和启动子 成串的非甲基化的CpG序列称为CpG岛