生物选修一(考点)资料

1、秦淮中学2015 秦淮中学2015 届高三生物一轮复习 分离纯化大肠杆菌的接种方法：划线平板法和稀释涂布平板法。接种后的培养基的培养： 置于 恒温箱 中 37 培养1 2d。挑取大肠杆菌菌落 多次进行接种培养可以纯化 大肠杆菌菌种。 20保存 ）菌种 保存方法 ： 20保存 ）（二）土壤中分解尿素的微生物的分离与计数：筛选原理及方法：（ 1）原理：尿素分解菌能合成 脲酶 ，能利用脲酶分解尿素 ，因此 可以尿素为氮源（ 2）筛选方法： 用 以尿素为唯一氮源的培养基培养土壤微生物进行筛选。实验方法步骤：本实验采用稀释涂布平板法和 活菌计数法。（ 1）土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土

2、3cm 左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中 。【 注意 】取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前 都要灭菌 。（ 2）制备培养基：按下列配方制备以尿素为唯一氮源的培养基。KH 2PO4Na2HPO4MgSO 4 7H2O葡萄糖尿素琼脂pH 调至7.0 7.2，加蒸馏水定容至1000ml1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0g需要设置无尿素 培养基 作空白对照，即：表中尿素用等量的无菌水 替换。3）土壤样品稀释：制备 不同稀释度的土壤悬液。方法如下：称取 0.5g 土壤 ， 倒入盛有50mL 无菌水的锥形瓶，振荡20min， 充分打散土壤，制成10 2g/mL 的土壤悬液。用

3、无菌移液管吸取0.5mL（ 10 2g/mL）的土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水 的号 试管，配制成10 3g/mL 的土壤悬液。取另一支无菌移液管吹吸 1 号管 3次 ，使悬液均匀，再吸取 0.5mL注入盛有.5mL 无菌水 的 2号 试管，配制成10 4g/mL的土壤悬液.。 依此类推 ，配制10 5、 10 6、 10 7、 10 8g/mL 的等浓度的土壤悬液。每次吸取土壤悬液前都要用移液管吹吸悬液3 次 的 目的 ： 使土壤悬液均匀 。 分离 不同的微生物采用不同稀释度（因不同微生物在土壤中含量不同 ） 。见下表：细菌放线菌霉菌稀释度104、 105、 106103、 104、 10

4、5102、 103、 104目的保证 获得菌落数在30 300之间 、适于计数的平板【提醒】人教版是配制10mL不同浓度的土壤悬液，其方法与上述方法相同。4）接种：采用（稀释）涂布平板法。具体操作如下：从 最低浓度 （ 10 8g/mL）土壤溶液开始 ，分别用无菌移液管吸取1mL（ 人教版为 0.1mL）加入到相应编号 的培养基中，每个浓度设置至少3 个 重复（三个平板） ，再用 涂布器 （玻璃刮铲）涂布均匀 。每次吸取土壤悬液前都要将土壤悬液充分振荡 ， 混合均匀 ；每一步都应做到无菌 操作。操作时，移液管和试管口应在离火焰1 2cm处 。实验时要对培养皿作好标记 。 注明 培养基类型、 培

5、养时间 、 稀释度 、 培养物 等。5）培养与观察：将已标明培养基种类、培养日期和样品稀释度的培养皿，倒置 放在 37 的 恒温箱 培养 1 2d，观察细菌菌落。（ 6）计数菌落：每隔 24h 统计菌落一次，选取菌落数目稳定时的数据作结果，以防 TOC o 1-5 h z 止培养时间不足而遗漏某些菌落。 计算时 应选择 菌落数 为 30 300 的平板上 进行计数 ， 要计算平均数。 每克样品菌落数（用液1mL） 某一稀释度重复培养 菌落 平均数 稀释倍数 。统计的菌落数比活菌的实际数目少。原因 是： 当 两个 或 多个细胞 连在一起时，平板上观察到的只是1 个菌落 。结果分析与评价： 同一土

6、样 的重复组统计的结果应相近 。若 未接种 的培养基中没有菌落 ，说明培养基未被杂菌污染，反之，则被污染 。若 空白对照组培养基上 有菌落生长， 原因 可能是 被固氮微生物污染或培养基中混入了其他氮源。若实验中得到2 个 或 2 个以上 菌落数在30 300 的平板，表明稀释 操作 成功 ， 可以进行计数统计。若同一稀释度的3 个重复的菌落数相差悬殊 ，表明试验不精确 ，需要 重新实验 。【知识拓展】1土壤中微生物数目的统计方法：包括： 直接计数法和 间接计数法（ 活菌计数法） 。（ 1）直接计数法：用 血球计数板制片后在 显微镜下 观察计数。取样计数方法与培养液中酵母菌计数方法类似 。土壤微

7、生物的稀释要求 ： 以达到 每小格内有 5 10 个菌体为宜。经稀释的土壤样品应重复计数3 次 ，取其 平均值 。 1mL土壤悬液中菌体总数= 4 106 每小格 中的 菌体数 土壤悬液 稀释倍数 。（ 2）间接计数法（活菌计数法）采用 稀释涂布平板法，统计 菌落数 进行计数。要设置对照和重复，每个稀释度土壤悬液至少 设置 3 个 重复 。选择 菌落数 为 30 300 的平板上 进行计数 ，并 计算平均数。每克土壤样品中菌落数菌落数 稀释倍数 涂布体积 。鉴定能分解尿素的微生物的方法： 脲酶检测法。1）原理： 尿素经脲酶分解后形成氨，使 pH升高，会使 酚红 指示剂 变红 。2）方法：在 以

8、尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红 ，若酚红指示剂变红 ，则 TOC o 1-5 h z 说明该微生物能分解尿素。（三）分离土壤中能分解纤维素的微生物：基础知识和原理：能分解纤维素的微生物都能分泌纤维素酶 ，该类微生物能以纤维素为唯一碳源。维素酶：是 一种复合酶， 包括：C1 酶 （ 外切酶 ） 、 CX酶 （ 内切酶 ）和 葡萄糖苷酶。纤维素C1 酶、CX酶纤维二糖葡萄糖苷酶葡萄糖刚果红： 能与纤维素 形成 红色复合物， 不能与纤维二糖和 葡萄糖 发生这种反应。 在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，能分解纤维素的微生物形成的菌落周围 由于 纤维素被分解，因此 不呈红色，而是 形成透明圈。操作步

9、骤：（ 1）土壤取样：应从 富含纤维素的环境中进行土壤取样。如：树林中多年落叶形成的腐殖土等。若找不到合适的环境，可将 滤纸埋在土壤中（深10cm）再取样。2）选择培养： 目的 ： 增加纤维素分解菌 的 浓度 （即： 浓缩 所需要微生物）按下表配方制备液体 选择培养基：纤维素粉5gNa2HPO4 7H2O1.2g溶解后加蒸馏水定容至1000mLNaNO31gKH 2PO40.9gKCL0.5g酵母膏0.5gMgSO47H2O0.5g水解酪素0.5g提醒 】 该培养基为液体 培养基，属于选择 培养基。 原因 是： 该培养基中虽然含有其他碳源（酵母膏 ） ，但 含量很少 ，培养基中的主要碳源还是纤

10、维素 ；在此种培养基中只有能分解纤维素的微生物 才能大量繁殖。 水解酪素 ： 提供 氮源 和 生长因子 。设计对照组培养基时，用葡萄糖 代替 该配方中 纤维素粉 。【操作】称取 20g 土样加入装有30mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上 ， 在一定温度下（ 30 ） ， 振荡培养1 2 天， 直至培养液变浑浊 。3）梯度稀释： 将 选择培养后的培养基进行等梯度 稀释101 107倍。4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上：制备鉴别培养基：按下表配方制备鉴别培养基。CMC Na（ 水溶性羧甲基纤维素钠）酵母膏KH 2PO4土豆汁琼脂溶解后加蒸馏水定容至1000ml5 10g1g0

11、.25g100mL15g涂布平板： 将稀释度为104 106的菌悬液各取0.1ml 涂布到平板培养基上， TOC o 1-5 h z 30倒置培养。5）刚果红染色法： 目的 ： 挑选产生透明圈的菌落 （筛选出纤维素分解菌）方法一 ： 先培养微生物， 再加入刚果红进行颜色反应。方法二 ：在 倒平板时就加入刚果红。方法一中要使用NaCl 溶液 ，其 作用 是： 漂洗作用 。即： 洗去 与纤维素结合不牢的刚果红 ， 使透明圈更清晰。 透明圈越大的 菌落 ， 产纤维素酶能力越强，分解纤维素的能力越强 。 两种染色鉴定方法的优缺点比较：染色法优点缺点方法一颜色反应基本上是 纤维素分解菌的作用操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂。操作简便，产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈方法二不存在菌落混杂问题有些微生物能降解色素，形成明显的透