SYBGreen染料荧光定量原理

1、sybgreen是用于QPCR的荧光染料，拟提出的问题实际上就是定量PCR(QPCR) 的原理和方法。可以参考有关书籍很多。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后 通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1.在荧光定量PCR技术中，有 一个很重要的概念 Ct值。C代表Cycle，t代表threshol，Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 2.荧光域值(threshold)的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号， 荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差

2、的10倍，即： threshold = 10 SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模 板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值 越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝 数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲 线上计算出该样品的起始拷贝数。4.荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光 化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1)TaqMan 荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探 针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光

3、基团和一个淬灭荧光基团。探针完 整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监 测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现 了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2) SYBR荧光染料： 在PCR 反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后， 发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保 证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。另一篇文章也可以阅读：用于荧光定量PCR仪的化学染料有多种，包括SYB

4、R Green I、分子Beacons、 水解探针（TaqMan探针）、ScorpionsTM探针和AmplifluorTM系统。也可完成实 时量化和DNA解链曲线。SYBR Green ISYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合 后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对 较低。此外，由于一个PCR产物可

5、以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I 的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引 物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确 性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响1。由解链 曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量结果。分子 Beacons分子Beacons是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探 针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠 近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂， 这一过程称为

6、荧光谐振能量传递（FRET）。由于黑色淬灭剂，由荧光基团产 生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其 释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子Beacons的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互 补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的 一端，而淬灭剂由连接于另一端。分子Beacons必须非常仔细的设计，以致于在 复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配 对后，分子Beacons的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发 时，它发出自身波长的光子。分子Beacons不同于SYBR Green的一个优点就是它特异性地检测感兴趣的 目标DNA。