天津市科技发展计划项目申请书(科技攻关重点项目)

1、王世鑫 武警医学院科研部武警医学院蛋白质组学实验室医学科研思维方法第一节 医学科研的思维方法一、白色、黑色和灰色系统与医学研究一客观世界划分为白色、黑色和灰色系统 系统论、信息论和控制论自从上世纪诞生以来，很快成为人们认识复杂客观世界新的哲学思想和方法体系。白色、黑色和灰色系统三个系统的划分，为科学研究从总体思维上廓清了大环境，为探索繁杂艰难的医学问题提出了一个可共选择的思维格局，便于根据问题的系统性状，来选择合理有效的研究技术和方法。从宏观上为医学科学研究建立了一个科学思维的框架。1、白色系统 系统的组成、结构、功能和机制四个因素的信息都完全清楚的系统称为白色系统。如一台CT他的全部组成成分

2、、内在结构、所具有的功能及操作运行机制都是完全清楚的。 白色系统是明朗的，过程是确切的。以往我们熟悉的科学研究大多属于白色系统问题。2、黑色系统 系统的组成、结构、功能和机制四个因素的信息所知甚微的系统，称之。比方：人的大脑神经系统的思维活动、生物遗传系统、生长发育的基因调控等。由于黑色系统问题认识很少，就决定了对黑色系统类问题研究的探索性，研究过程的复杂性和研究结果的不确切性。甚至表现出一定的被动性和盲目性。 3、灰色系统系统的组成、结构、功能和机制等方面的信息都有局部把握的系统，称之。是介于白色与黑色之间的一类系统。比方人体生命过程，已了解了大体组成结构，根本生理功能及局部起支配作用的原理

3、，然而，还有许多未知问题。如大脑、衰老、癌症等过程。 二白色、黑色和灰色系统间的相互关系 从黑色系统到灰色系统，再到白色系统，不仅仅只是一种划分客观世界的思维框架，而且反映了人们认识客观事物研究认识层次的深化。灰色系统黑色系统白色系统科学研究白色、黑色和灰色系统间的相互关系三统计学是进出白色和和黑色系统的钥匙统计学是应用数学的一个分支，不仅可研究白色系统问题，更为重要的是，它能协助分析处理属于黑色系统领域的问题。 黑色系统里的问题往往很难得到确切的结论，而统计学恰恰可以帮助对这种“不确定性做出定量推测性结论。 白色系统类问题灰色系统类问题黑色系统类问题一般数理化技术与方法模糊数学技术与方法统计

4、学技术与方法专业知识技术与方法图 研究不同系统类问题所需的知识技术结构二、整体、系统的思维方式 系统生物学根据胡德的定义，系统生物学是研究一个生物系统中所有组成成分基因、mRNA、蛋白质等的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科。 也就是说，系统生物学不同于以往的实验生物学仅关心个别的基因和蛋白质，它要研究所有的基因、所有的蛋白质、组分间的所有相互关系。系统生物学是以整体性研究为特征的一种大科学。系统生物学全球开展热点美国能源部2002年启动了21世纪系统生物学技术平台麻省理工学院和哈佛大学成立了系统生物学研究机构中国科学院生命科学研究所与上海交大于2003年联合成立了上海系统生物学

5、研究所德国、日本、韩国、新加坡、菲律宾等国成立了系统生物学研究机构 系统生物学将是21世纪医学和生物学的核心驱动力。Leroy Hood，人类基因组方案的发起人之一世界上第一个系统生物学研究所Institute for Systems Biology founded by Leroy Hood in 1999 系统生物学的灵魂就是整合性思维方法，是指研究思路和方法的整合。和以往科学研究的区别：经典的分子生物学研究是一种垂直型的研究。 即采用多种手段研究个别的基因和蛋白质。首先是在DNA水平上寻找特定的基因，然后通过基因突变、基因剔除等手段研究基因的功能；在基因研究的根底上，研究蛋白质的空间结构

6、，蛋白质的修饰以及蛋白质间的相互作用等等。基因组学、蛋白质组学和其他各种“组学那么是水平型研究。 即以单一的手段同时研究成千上万个基因或蛋白质。系统生物学整合性的研究方法模型模拟预测数据实 验比 较建立/修改模型生物学知识生物系统 系统生物学的思维特点，那么是要把水平型研究和垂直型研究整合起来，成为一种“三维的研究。 此外，系统生物学还是典型的多学科交叉研究，它需要生命科学、信息科学、数学、计算机科学等各种学科的共同参与。系统生物学研究所的第一篇研究论文，就是整合酵母的基因组分析和蛋白质组分析，研究酵母的代谢网络。VEGF protein is secreted outside the cel

7、ls and binds to its receptor on the endothelial cells to promote their growth. 第二节 医学科研选题与创新一、创新的意义 创新是一个民族开展的灵魂，是科学研究的生命线，研究内容上的创新性是科研选题得以成立的根本条件。 科学创新有三个层面的涵义：原始性创新；集成性创新；引进、消化型创新。 衡量课题的先进性，主要考核它的创新性如何。二、创新度评价理论 科技成果的创新度往往与其科研成果发表前论文检索的重复率和发表后论文检索的引用率具有一定的相关性。这种相关性主要表现为论文检索的重复率越大，其创新性越小，重复性越小，其创新性

8、越大；论文检索的引用率越大，其创新性越大，引用率越小，其创新性越小。从科学计量学上，科技成果论文检索的重复率曲线(D)和论文检索的引用率曲线(S)之间在坐标系里必然存在一个均衡点。我们可以根据这个均衡点和均衡状态评价科技成果创新的程度。创新度P 创新度P 创新度PDSEDS科技成果数QQeOPeP1P2Q2Q1Q3Q4第一种情形是：当科技创新度为P1时，科技成果的引用数为Q1，而科技成果的重复数为Q2，形成科技成果引用率大于科技成果重复率。即OQ1OQ2。科技创新度高。第二种情形是：当科技创新度为P2时，科技成果的重复数为Q3，而科技成果的引用数为Q4，形成科技成果重复率大于科技成果引用率。即

9、OQ3OQ4。科技创新度低。科技创新的一般均衡曲线和均衡科技创新度的形成示意图 根据以上科技创新的一般均衡曲线可以看出以下几种情况： (1)从一般均衡曲线上可以看到，E点以上部位的科研成果，由于其重复率小、引用率大，因此，其科技创新性就强，科技成果价值就大。反之，在E点以下，其创新性就弱，科技价值就小。 (2)当某项科研成果其重复率为零时，其科技成果引用率即反映出其创新程度；当其引用率为零时，其重复率即反映出其创新程度。 (3)当某项科技成果的重复率和引用率都为零时，说明此项科技成果的创新度为零。 (4)衡量科技成果创新度科技价值的大小既取决于其科技成果重复率大小，也取决于其科技成果引用率大小

10、。重复率和引用率可以看成是科技研究领域非常重要的两种根本力量，它们之间的相互作用决定了科技成果创新性的大小。 创新人才；创新环境和平台；创新制度；创新思维与学科交叉。 三、科研创新的来源第三节 临床蛋白质组学人类基因组方案国际大合作：英、美、法、日、德、中主要包括基因定位和全序列测序 遗传图、物理图、全序列Dulbecco 于1986年提出1990年由美国能源部和国立卫生院启动。Many GenomeThe public project estimates that there are 31000 protein-encoding gene, whereas Celera finds 2600

11、0, with many more still to be found.6000 for a yeast13000 for a fly18000 for a worm26000 for a plant (Genomes Online Database) Eukaryotic cells is more like six to eight protein per genemaybe several hundred thousand human proteins after splice variants and essential posttranslational modification O

12、ne Genome Many Proteins蛋白质的多样性生命的统一性在于基因组，生命的多样性在于蛋白质组。生命功能的最终执行者。Proteome“The total PROTEin composition of a genOME. M. Wilkins et al. Electrophoresis 1995, 16, 1090-1094Proteome describes the complete set of proteins that is expressed, and modified following expression, by the entire genome in the

13、 lifetime of a cell. It describes the composition of proteins expressed by a cell at any one time.Proteomes are dynamic!mRNA ExpressionProtein ExpressionDuodenum smooth muscleBrain hippocampusBlood vessel basal arteryLung 3 bronchusBrain substantia nigriaCell line HeK293Brain caudate putamenKidney r

14、enal cortexLung 4 bronchusStomach body smooth muscleUmbilical cord wholeCeacum smooth muscleTonsil (lymph node)Cell line 132N1Brain amygdalaIleum mucosaPituitary gland wholeBrain cerebellumLung parenchymaBrain frontal cortexForeskinStomach antrum smooth muscleJejunum mucosaPancreas wholeColon mucosa

15、Bladder fundus outer wallLung whole Oesphagus mucosaStomach fundus smooth muscleBrain putamenBrain medulla oblongataIleum adiposeThyroid glandPlacenta wholeOesphagus smooth muscleIleum smooth muscleKidney pelvisLiver anterior right lobeBlood vessel pulmonary arteryColon taeni coliUterus myometrium (

16、myometrial)Blood vessel cerebral arteryLung 2 bronchusLung trachae wholeStomach fundus mucosaStomach body mucosaHeart pericardiumCeacum mucosaSpleen wholeGall bladder wholeBrain hypothalamusBrain caudateAorta wholeBladder trigoneTestes wholeColon smooth muscleBrain superior frontal gyrusBrain striat

17、umLung 1 bronchusKidney renal medullaSkeletal muscleBrain choroid plexusKidney ureterDuodenum mucosa540132Differential Expression at Differential temperature ABE. Coli grown at 30 CE. Coli grown at 42 CProteomicsProteomics is the study of protein properties on a large scale to obtain a global, integ

18、rated view of disease processes, cellular processes and networks at the protein level.Cytoplasmic proteins蛋白质组学包括：表达蛋白质组学功能蛋白质组学结构蛋白质组学P07155P07155Y43753Y43753ABkDa255.55.5pIStructural Genomics DNAFunctional Genomics RNAStructural Proteomics PROTEINFunctional Proteomics PROTEINSequencingMappingDNA A

19、rraysBioinformaticsGene ExpressionDNA ArraysTransgenesis2-D GelsMass SpecProtein ChipsBioinfomaticsProtein ChipsYeast 2-HybridTransgenics3-D StructureBioinformaticsGenomics and ProteomicsVEGF protein is secreted outside the cells and binds to its receptor on the endothelial cells to promote their gr

20、owth.一条是力图“查清人类大约3万到4万多基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质组数据库，即组成蛋白质组学；另一条途径，那么是着重于寻找和筛选引起2个样本之间的差异蛋白质谱，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，即比较蛋白质组学研究。蛋白质组学研究途径 这是一种针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对生命活动的全景式认识。 但目前在短时间内建立人类蛋白质组学“完整的数据库和实现网络资源共享的条件尚未成熟。组成蛋白质组学研究(结构蛋白质组

21、学)虽然在微生物中，基因组、转录组根底上的蛋白质全谱研究已有成功报道，但在高等生物尤其是哺乳动物中未见报道，人类组织或细胞的蛋白质组全谱刚刚起步(肝)。开展筛选特定情况(疾病)下的蛋白质组中特殊标志蛋白与关键蛋白的研究(差异蛋白质组学)，迅速推广应用，是一种更符合中国国情的切实可行的研究途径。比较蛋白质组学研究(差异蛋白组学、功能蛋白质组学)以生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理、病理过程的比较蛋白质组学研究，是比较蛋白质组学研究的核心。正常对照组 矽尘暴露(0)组 可疑矽肺(0+)组 一期矽肺(I)组补体C4富含亮氨酸的-2糖蛋白-1抗胰蛋白酶-1抗胰蛋白酶 图3 可疑矽肺（0+）组血

22、清中表达有显著差异的蛋白质转铁蛋白可以说差异蛋白质组学是功能蛋白质组学研究的一局部，通过参与不同生理病理过程蛋白质种类和数量的比较，寻找重要生理过程中的关键蛋白和导致疾病发生的标志性蛋白的这类研究，现在正获得国内外临床蛋白质组学研究者日益增多的关注。Diseased Healthy临床蛋白质组学(clinical proteomics)蛋白质组学的研究已涉及到临床的各个方面： 1.诊断：如疾病筛查、疾病分期分型等。生物标志物(biomarker)。对于在特定疾病中的特定蛋白质的深入研究，为疾病的病因、发病机制，疾病临床分期分型提供了分子根底。 2.指导治疗：如病程分析、用药、手术时机的选择等。

23、 3.提供药物开发的临床依据：如确定药物靶点、新药开发等。 4.预后判断：根据生物标志物在不同疾病中的变化，判断疾病性质和严重程度等。 临床蛋白质组学研究技术简介临床蛋白质组学生物标志物发现经典技术方案生物样品(组织、体液、细胞、细菌或病毒等)2cICAT(Duplex Samples)与iTRAQ(Multiplex Samples)生物标志物的发现(BioMarker)2-D 胶染色图象分析酶解肽 混 合 物4800MADI-TOF-TOF 肽碎片序列测定(MSMS)肽质量指纹谱(PMF)蛋白质信息学/数据库检索Bioinformatics样本预处理总蛋白酶解混合物蛋白质鉴定PROTEIN

24、 IDBiomarkers功能研究蛋白质翻译后修饰鉴定A蛋白质研究关键技术产 品Products结构研究/细胞筛选cDNA克隆/重组表达/药物设计/疾病诊断等Nano-HPLCBC(一)蛋白质指纹技术SELDI-TOF/MS 疾病早期预警新里程碑 化学表面 蛋白质表达剖析 :(反相疏水) (阴离子)(金属离子)(正相亲水)(阳离子)蛋白芯片外表介绍(PS-1 or PS-2)(抗体 抗原)(受体- 配体)(DNA 蛋白质)生物表面 蛋白质相互作用检测: 化学外表芯片的蛋白质剖析过程OrganicDetergentSaltWaterpHUreaCHAPSImidazol洗脱条件Wash Cond

25、itions芯片外表类型 Surface Type飞行质谱检测Measured m/z2500500075001000002040605807.5(二)液体芯片技术路线简图1. 血清总蛋白差异蛋白组分析3. 血清低分子量蛋白蛋白组分析2. 血清糖蛋白差异蛋白组分析血清蛋白组学分析血清蛋白组学分析策略(三)基于双向电泳的血清蛋白质组学研究血清样品处理切点酶解MS图谱结果鉴定二维电泳 MALDI TOF/TOF 鉴定Western Blotting 验证Real time PCR 验证生物信息学分析血清样品处理ESI MS/MS 鉴定数据分析及差异点切割成功否进一步的功能实验及药物靶标的分析成功技

26、术路线(四)悬浮芯片及临床应用悬浮芯片技术(SAT) 由100种不同颜色标记的一系列微球体xMAP技术组成，每个微球体可偶联一个对应的不同靶分子特异反响物。 能同时对在不同基质包括细胞培养悬浮液、血清和血浆中的细胞因子、生长因子等进行定量测试。大多数试验，每次仅需12L的样本量。xMAP的标记抗体共价结合在微球外表每个小球通常结合几千个抗体也可以是探针、抗原、酶、核酸、糖蛋白、其它配体等悬浮芯片技术原理xMAP混合 多种微球对应多种目标分子反响原理混合好的微球与样品反响样品中的目标分子抗原与微球上的第一抗体结合参加生物素标记的检测抗体用第二抗体检测可以增加特异性二抗标记有生物素，可以方便的加上

27、荧光分子fluorescent tag是为了方便定量DATA!DATA!DATA!DATA!Ex1Ex2Em1Em3Em2DD Read 100 each color bead in assay 1 - 100 bead sets avail.悬浮芯片检测过程图示技术特点线性范围： 可调1.95 32000pg或0.23200pg检测效率：35min/96孔板 20s完成一个样品的100种指标的检测。悬浮芯片的应用临床辅助诊断药物筛选中低密度基因、蛋白多工程检测生理学病理学药理学研究 二、开展工程 一Cytokines IL-1 IL-1 IL-1raIL-2 IL-2RIL-3 IL-4 I

28、L-5IL-6 IL-7IL-8 IL-9IL-10 IL-12(p40) IL-12(p70) IL-13 IL-15 IL-16IL-17 IL-18 Basic FGFG-CSFGM-CSFGRO- HGFICAM-1IFN- 2IFN-IP-10LIFMCP-1(MCAF)MCP-3M-CSFMIFMIGMIP-1MIP-1NGFPDGF-BBCTACKEotaxinRANTESSCFSCGF- SDF-1TNF- TNF- TRAILVCAM-1VEGFHuman(50小鼠32IL-1 Basic FCF TNF- IL-1 Eotaxin VEGFIL-2 G-CSFIL-3 GM

29、-CSFIL-4 IFN- IL-5 KCIL-6 LIFIL-9 MCP-1(MCAF)IL-10 M-CSFIL-12(p40) MIGIL-12(p70) MIP-1IL-13 MIP-1IL-15 MIP-2IL-17 PDGF-BBIL-18 RANTES大鼠9IL-1IL-1IL-2IL-4IL-6IL-10GM-CSFIFN-TNF-二Biomarker多肿瘤标志物联合检测 艾芯TM肿瘤全套9项AFP&CEA双检液芯常规体检2项肺芯TM肺癌4项消芯TM消化肿瘤5项妇芯TM妇科肿瘤5项PSA双检液芯前列腺癌2项三磷酸化蛋白和总靶蛋白人、鼠、猴磷酸化蛋白26Akt(Ser473) J

30、NK (Thr183/Tyr185)ATF-2(Thr71) MEK1 (Ser271/Ser221)c-Jun(Ser63) NK-Bp65(Ser536 )CREB (Ser133) p38 MAPK(Thr180/Tyr182)EGFR(Tyr) p53 (Ser15)ERK1(Thr202/Tyr204) p70 S6 kinase(Thr421/ Ser424)ERK2(Thr185/Tyr187) p90 RSK(Thr359/ Ser363)ERK1/2(Thr202/Tyr204, Thr185/Tyr187) PDGF receptor-(Tyr751)GSK-3/(Ser2

31、1/Ser9) S6 ribosomal protein (Ser235/Ser236) Histone H3(Ser10) STAT2 (Tyr689)HSP27 (Ser78) STAT3 (Tyr705)IB- (Ser32/Ser36) STAT6 (Tyr641)IRS-1 (Ser636/Ser639) TrkA (Tyr496)总靶蛋白12Akt(Ser473) HSP27 (Ser78)ATF-2(Thr71) IB- (Ser32/Ser36)c-Jun(Ser63) JNK (Thr183/Tyr185)CREB (Ser133) MEK1 (Ser271/Ser221)E

32、RK2(Thr185/Tyr187) p38 MAPK(Thr180/Tyr182)ERK1/2(Thr202/Tyr204, Thr185/Tyr187) p90 RSK(Thr359/ Ser363)我们建立的局部血清细胞因子正常参考值IL-8IL-10IL-64.752.54pg/mL0.290.07 pg/mL武警医学院临床蛋白质组学研究平台(ProteomeWorks System)Part I样品制备区Sample Preparation公用实验区Public InstrumentsPrep 491分子量别离系统(分子量不同将蛋白分开Part IV自动蛋白切取及质谱接入Spot C

33、utter&Mass 公用实验区Public InstrumentEXQuest Spot Cutter with Fluorescent蛋白自动切取系统带荧光Mass Import 质谱接入Bio-Plex悬浮蛋白芯片鉴定系统Part III成像分析区Imaging Analysis公用实验区Public InstrumentsChemiDoc XRS荧光化学发光成像系统 生物信息学工作站Worksbase Bioinformatics Workstation 消耗品供给 Consumable SupplyIEF(一维等电聚焦系统 +Mini P 3 +PROTEAN II XL(二维凝胶电

34、泳系统2块胶 + PROTEAN II Dodeca Cell(12块胶系统高通量工作DodecaStainer全自动染色仪Part II双向电泳区2D ElectrophoresisPDQuest二维分析数据库软件 王世鑫，男，学历：Ph. D. 职称：教授。享受政府特殊津贴和军队一类岗位津贴。博士、硕士导师。指导研究生30人，主编和参编学术专著8部，发表学术论文120余篇,SCI收录8篇。 研究方向:1、武警军事职业危害因素防治。 2、器官纤维化的蛋白组学。 学术兼职：1国家自然科学基金委评审专家库成员2天津市科委评审专家库成员3天津市劳动卫生职业病学会 副主任委员3中华预防医学杂志编委会

35、委员4中国实用内科学杂志编委会委员5武警医学杂志编委会委员6武警医学院学报编委会委员7武警部队科委会委员承担的主要科研工程矽尘暴露人群血清相关效应蛋白及其变化时间窗研究工程负责人，2007年国家自然科学基金面上工程，编号：30771788, 资助经费32万元。矽肺早期诊断筛检生物标志物研究工程负责人，2006年天津市卫生局科技攻关工程， 资助经费20万元。矽肺早期诊断筛检生物标志物研究，2006年天津市卫生局科技攻关工程， 资助经费20万元。 手掌参对染矽尘大鼠肺组织、型胶原的影响及其抗氧化机制的研究2006年国家自然科学基金工程，工程负责人，26万元SARS康复人员基因多态性及蛋白质指纹图谱

36、研究， 2005年天津市科委重大攻关重点工程 ，课题负责人，30万元。SARS爆发流行后医院内感染危险因素及疫源地血清流行病学研究, 2003年天津市卫生局重点工程，课题负责人，12万元。矽肺早期诊断筛检特异性生物标记物及蛋白质芯片指纹图谱的建立 2003年天津市科技攻关方案培育工程 课题负责人，20万元。牛磺酸与烟酸对矽尘致纤维化的保护及机制研究，2001年国家基金工程 ，课题负责人，16万元。发表的主要论文1 Lianteng Zhi, Gangqiao Zhou, Hongxing Zhang, Yun Zhai, Hao Yang, Fang Zhang, Shixin Wang,Ma

37、oti Wei, Wuchun Cao &Fuchu HeLack of support for an association between CLEC4M homozygosity and protection against SARS coronavirus infectionNATURE GENETICS，2007,39(6):692-694( SCI收录,IF24.59)2 Shi-Xin WANG, Xue-Feng ZHAO, Jia-Wei Zeng, et al. Screening of serum biomarkers and establishment of decisi

38、on-tree in silica-exposed populations by SELDI-TOF-MS JJOEM. 2007,49(7):764-770 (SCI收录,IF1.88)3 WANG Shixin, LIU Ping, Wei Maoti, et al. The roles of serum CC16 and SP-D on early diagnosis and progression of silicosis JJOEM. 2007,49(8):834-839 (SCI收录,IF1.88) 4 Sh.X. Wang, Y.M. LI, B.C. Sun, , , , K.

39、X,Chen, , , , and . The SARS outbreak in a general hospital in Tianjin, China-the case of super spreader. Epidemiology and Infection. 2006,134:786-791收录(SCI收录,IF1.79)5 PEI Li-ying, GAO Zhan-cheng, YANG Zhen, WEI Dong-guang, WANG Shi-xin, JI Jian-min, JIANG Bao-guo. Investigation of the influencing f

40、actors on severe acute respiratory syndrome among health care workers. Journal of peking university(health sciences). 2006,38(3):271-275 6 WangShiXin,Weimaoti,Yangzhen, et al. A seroepidemiological study on SARS after the outbreak in a hospital .International Workshop on Epidemiological Studies of the SARS Outbreak in China 7 WANG Shixi