2022执业药师考试综合辅导：胞嘧啶脱氨酶基因治疗消化道肿瘤

1、2022执业药师考试综合辅导：胞嘧啶脱氨酶基因治疗消化道肿瘤胞嘧啶脱氨酶基因导入肿瘤细胞可将无毒性的原药在肿瘤细胞内代谢为具细胞毒的产物而发挥抗肿瘤效应。本文综述了该基因的克隆、作用机制和在消化道肿瘤治疗中的讨论进展。随着分子生物学的迅猛进展，基因治疗这一崭新方法尽管还多处于试验讨论手段，却已显示出良好的应用前景。自1991年Huber等提出病毒导向的酶解原药疗法以来，有关的基因讨论成为热门课题。目前，一个新的基因治疗系统EC-CD/5-FC系统正日益受到高度关注。本文就胞嘧啶脱氨酶基因治疗消化道肿瘤的现状作一综述。CD基因的克隆胞嘧啶脱氨酶是大肠杆菌代谢旁路中的一种酶，哺乳动物细胞中不含该酶

2、。Austin等于1992年首先从大肠杆菌株中采纳传统方法提取质粒DNA,进一步分别、纯化并转染宿主菌，初步构建成原核细胞中表达的CD质粒载体，克隆了编码CD的大肠杆菌基因，利用阳性基因筛选方法，获得一携带10.8kb的DNA插入质粒，其中一 3kb的DNA片段保存有CD酶活性。CK蛋白质分子量为52022, DNA序列分析显示一含427个氨基酸开放读码框架编码CD。为证明CD基因在真核细胞中表达以发挥作用，讨论者采纳寡核昔酸突变技术，将CD基因起始密码子由GTG-ATG,从而产生一 5起始密码子，选择pRc/CMV真核表达载体，构建成真核表达质粒pCMV/CD-1。以脂质体法将pCMV/CD

3、-1导入人结肠癌WiDr细胞系，生长抑制试验显示转染后的结肠癌细胞对5-FC的IC50为30umol,而未转染的结肠癌细胞其IC50为17000 umol,说明转染有CD基因的结肠癌细胞对5-FC的敏感性提高了近560倍。CD基因转移方法安全有效的基因转移方法是基因治疗的关键因素之一。至今，作为基因转移的载体，以病毒性载体介导的方法讨论最为系统深入，几乎应用于全部的靶系统。在消化道肿瘤的CD基因治疗中，既往的讨论仍选择逆转录病毒载体，这与对其基因组构造和生活周期了解得较清晰有关。RV载体大多由Moloney小鼠白血病病毒构建而成，为RNA病毒，基因组编码在一条单链RNA分子上，进入细胞后，逆转

4、录成双链DNA,此DNA进入细胞核整合在受体细胞DNA上，并以此为模板合成病毒基因和后代RNA。采纳RV转导CD基因，将CD基因整合于病毒长末端重复的最末端，因而整合后的病毒基因构造可受到爱护不致受损。目前转导CD基因多项选择择腺病毒载体。由于腺病毒为一双链DNA病毒，宿主范围广泛，尤其能有效地感染非分裂状态的细胞，另外，它不能整合到宿主细胞染色体上，因而较逆转录病毒更为安全。重组腺病毒载体主要来自于2型和5型腺病毒，容量大，可装载达7.6kb。已有学者选用Ad载体介导CD基因转染入结肠癌HT29细胞系，将携带有大肠杆菌标记基因的腺病毒注射到肿瘤组织中底物X-gal染色来推断基因转染效率。结果

5、显示外源基因经单次注入后近5%-30%的肿瘤组织表达Lacz基因。作用机制由于哺乳动物细胞中不存在CD，因而不能将胞嘧啶转化成尿嘧啶，更不能将5-氟胞嘧啶转化成5-氟尿嘧啶。但通过基因转移技术将CD基因转入哺乳动物细胞，则哺乳动物细胞可将一些原来无毒性的原药转化为有细胞毒性的代谢产物，导致细胞自杀性死亡。5-FC在高度抗微生物活性的浓度下对哺乳动物无毒性作用，经CD脱氨为5-FU，后者则具有高度细胞毒性，为临床广泛使用的抗肿瘤化疗药物。CD基因作用的一个非常突出特点即所谓的“旁观者效应，这与某些自杀基因的作用机制相像。Hirschowitz等最早观看到CD基因治疗结肠癌时的这一效应，当CD+的

6、结肠癌细胞与CD-的结肠癌细胞混合时，比拟了 CD+的细胞比例为10%和100%时两者的细胞生长抑制水平，结果无显着性差异。对旁观者效应尚缺乏准确的解释，但大多同意“缝隙连接引起旁观者效应，通过细胞间的接触，毒性代谢产物由“缝隙连接从CD+的细胞转入CD-的细胞，从而使得后者变得原药也敏感了，并被原药代谢产物杀死。但亦有学者提出不同意见，Trinh等通过电镜发觉在肿瘤组织邻近区域有大量的“桥粒存在，因其起着封闭细胞间转运的作用，推想旁观者效应并非上述机制，尚有其它机制参加，如细胞凋亡、原药代谢产物本身可穿过细胞膜等可能机制。几种消化道肿瘤CD基因治疗现状结肠癌CD基因治疗的讨论对象以结肠癌为多

7、。Huber等观看到*鼠5-FC的半衰肠期大约是40分钟，腹腔内赐予500mg/的5-FC,其血浆水平可维持在4000 u molo体外试验显示：对于CD+结肠癌细胞，5-FC的IC50仅为5umol；而体内试验结果说明无论是腹腔内还是静脉内赐予5-FC，都同样观看到明显的抗肿瘤效应。Richard等将组织特异性因子癌胚抗原转录调控序列的三个局部分别插入到含CD基因的pCMV/CD-1中，构建了 一系列pCEA/CD基因载体，通过分析荧光素活性，筛选出活性的pCEA/CD-145基因。体外试验将其转导入大肠癌NCIH508细胞中，在5-FC存在下，基因表达发挥出良好的原药转换抗肿瘤效应，CD+

8、的NCIH508细胞其IC502umol,而CD的NCIH508细胞其IC50达516umol0体内试验比拟转导前后的大肠癌细胞*鼠体内成瘤后，赐予5-FU500 ug(kgd,)，连续20日，细果显示未转导CD的大肠癌细胞成瘤*鼠肿瘤重量增加了近3倍，而转导CD的大肠癌细胞成瘤*鼠肿瘤重量根本未转变。肝肿瘤肝原发或继发肿瘤的基因治疗讨论报道最多。由于肝脏是结肠癌最常转移的部位，因此，Ohwada等在建立结肠癌肝转移动物模型的根底上，赐予人结肠癌荷瘤*鼠肝内注射AdCMV.CD和腹腔内每周二次赐予5-FC,以点杂交分析肝内人结肠癌细胞DNA数量来推断抑制转移瘤效果。结果与对比组相比，治疗组肝内

9、人结肠癌细胞DNA数量显着低于各对比组，级组织学检查显示治疗组注射部位肝肿瘤消失坏死，对比组未见此现象，且治疗组中正常肝组织仅见稍微的、可恢复的炎症，未见坏死。最近，Kanai等报道选择甲胎蛋白启动子/增加子，构建重组腺病毒载体AdAFP-CD和AdAFP-Lacz,分别转染AFP+的肝癌细胞系和AFP-的肝癌细胞系，结果显示：在前者，目的基因转移效率显着提高，5-FC的IC50为136.6umol,而后者的 IC50 达 24651 u molo胰腺癌癌基因ERBB2在多种肿瘤尤其在胰腺癌、乳腺癌等肿瘤组织中呈高表达，而在正常和炎症胰腺组织未见这种高表达，因此,Harris等以ERBB2转录

10、调整序列中一含544个碱基对的DNA片段启动CD基因，选择逆转录病毒载体转染胰腺癌细胞HPAF、Panel和乳腺癌细胞T3M4, HPAF细胞呈高表达、Panel细胞呈中度表达、而T3M4细胞不表达ERBB2。检测结果说明未转染的上述三种细胞检测不出CD酶活性，而转染后其CD酶活性分别为每分钟958.3、344.5和0pmol/109每分钟109细胞产生尿嘧啶的微摩尔量。在前两组，赐予5-FC后，转染CD的胰腺癌细胞生长明显受抑，而在T3M4组，细胞生长则未见明显转变。近来，Evoy等报道选用腺病毒载体，胜利将CD基因转染胰腺癌细胞，同样在体内、体外观看到明显的抗肿瘤效应。胃癌大约40%的胃癌

11、表达CEA, Lan等采纳CEA启动子作为靶向性因子，构建了重组病毒载体AdCEA-Lacz和AdCEA-CD,分别转染CEA阳性胃癌细胞系MKN45、MKN28和CEA阴性胃癌细胞MKN1,体内和体外试验显示Lacz基因选择性只在CEA阳性胃癌细胞中表达；另外，AdCEA-CD转导后上述三类细胞对5-FC的敏感性各有不同，5-FC的IC50分别是88.307和16935umol,细胞对5-FC的敏感性分别提高了 73、267和1.1倍。结语无论是RV还是Ad载体，均不是最抱负的基因转移载体，设计安全、高效、稳定、特异、可控、简便易行并可携带不同长度DNA的新载体仍是基因治疗讨论中急待解决的问题；另外，综观某些文献，对比组设置均为各种肿瘤细胞，缺乏肿瘤细胞与骨髓细胞、肠上皮细胞和生殖细胞等化疗药物敏感组织细胞的比拟，讨论基因治疗肿瘤的目的不是为了比拟各种肿瘤细胞间的差异，而应比拟肿瘤与癌旁组织和其它正常组织细胞间的差异；再者，某些体内试验结果尚难确定其对试验性肿瘤具有治疗作用亦或预防作用。尽管如此，现有的讨论