RNA干扰技术的特点

1、RNAi具有的特征RNAi是转录后水平的基因沉默机制；RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度， 而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑 制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维 持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp 左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsR

2、NA不能在 哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和 凋亡；ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是 一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。RNAi的生物特性RNAi抑制转座子活性两方面的证据提示转座子活性的抑制与siRNA有关发现蠕虫mut-7基因参与RNAi并且与转座子的转座抑制有关；在果蝇中，参与RNAi的RNA解螺旋酶Spindle-E的突变将导致该基因引起 的基因沉默的缺失，同时提高了反转录转座子活性。RNAi抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现，sgs2/sde1

3、基因突变的拟南芥对病 毒的侵染表现出高度的敏感性。RNAi参与异染色质的形成和维持Hall等研究表明，着丝粒同源重复序列和RNAi组分一起正负调节着异染色质的 形成并共同促使异染色质组装成核;Vople等在敲除裂殖酵母(S. pombe)的RNAi 途径基因(如Argonaute、Dicer、RDRP)时发现异染色质转录得到的dsRNA可 以在RNAi途径的参与下，加工成si RNA,si RNA募集异染色质蛋白1( HP1),然后 靶向性引起相应异染色质区域的转基因沉默。RNAi参与机体的发育调控及生理代谢RNAi只抑制转录后的基因，所以RNAi在生物体发育学研究中具有优势。Chuang 等

4、用RNAi技术进一步证实了 AG、CLV3、AP1、PAN等已知功能基因在拟南芥 花发育过程中的功能。在RNAi过程中形成的RISC复合物可根据不同情况分别 利用si RNA或stRNA行使不同的功能，但最终均导致特定基因沉默。1.高效性：Elbashir等在研究中发现分别为25 nmol/L与100 nmol/L的起始双链 RNA产生的结果是一样的，只是高浓度起始的更有效些。将双链RNA浓度降低 到1.5 nmol/L时产生的基因沉默效果变化不大，只有当浓度降低到0.05 nmol/L 时，沉默的效果才消失。Holen等也证实1100 nmol/L的双链RNA浓度对基因 沉默的效果是一致的。

5、这说明双链RNA介导的基因沉默效率是相当高的。需要 ATP： Zamore等认为RNAi过程中至少有2个步骤需要能量的供给：一是长的双 链RNA被Dicer所酶切产生双链RNA；二是在双链RNA与RISC结合解链后形成 有活性的RISC。.特异性：日bashir等和Brummel kamp等发现在2123个碱基对中有12个 碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。.位置效应：Holen等根据人TF（tissue factor）不同的位置各合成了 4组双链RNA 来检测不同位置的双链RNA对基因沉默效率的影响。在不同浓度和不同类型的 细胞中，hTF167i和hTF372i能够抑制85%90%的

6、基因活性，hTF562i只能抑制 部分基因活性，而hTF478i则几乎没有抑制基因的活性。他们还以hTF167为中 心依次相差3个碱基对在其左右各合成了几组双链RNA,有趣的是它们所能抑制 该基因活性的能力以hTF167为中心依次递减。特别是hTF158i和hTF161i只与 hTF167i相距9个和6个碱基，但它们几乎没有抑制该基因活性的能力。结果还 表明双链RNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC含量较低的 mRNA被沉默效果较好。.竞争效应：Hoten等将10 nmol/L和30 nmol/L的hTF167i相比，两者的沉默基 因效果无差异，但将20 nmol/L基因抑制效

7、果很差的PSK314i和10 nmol/L的 hTF167i相混和后，hTF167i产生的抑制效果明显降低。.可传播性：在线虫中，双链RNA可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全 身。Feinberg和Hunter在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白SID1,它可以将双链 RNA转运出细胞，因此系统性的RNAi包括了 SID1介导的双链RNA在细胞间的 运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物，因此在果蝇上通过注射产生的 RNAi不能扩散。植物中RNA干扰具有如下特点：（1）在确定基因功能时具有靶向性，在一个沉默 载体中插入部分基因序列就能确定某一基因的功能；能用来选择性地沉默某 一基因家族中的单个

8、基因或同时沉默一个基因家族中的多个基因；（3）PTGS能确 定在敲除后发生发育早期死亡的基因功能；（4）PTGS具有系统性，可以通过植物 的维管系统传递到植物的其它部分；（5）PTGS易于用于大规模、高通量的系统研 究。人们通过构建RNAi文库已成功的对线虫胚胎发育进行了研究，此项工作在 植物体系的研究中也正不断取得进展。1.比同源重组法更加简便，周期大大缩短。2.对于哺乳动物，如对于一些 敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi 技术研究它的功能。3.由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研 究信号传导通路的良好工具。4.R N Ai还被用来研究在发育过程

9、中起作用的 基因，如可用RNAi来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的 增殖和分化过程中起着关键作用。RNAi途径主要存在于细胞浆中，与反义核酸、核酶相比，RNAi具有以 下特点。特异性。siRNA是严格按照碱基配对法则与靶mRNA结合的， 故只引起同源mRNA的降解。研究表明，在siRNA 21-23个碱基 中，错配12个碱基就会大大降低干扰效应。遗传性。dsRNA分子 可扩散至生物体各个细胞，干扰效应可遗传给后代。研究表明，通过注射或浸泡 siRNA,在二代线虫中仍可观察到对靶基因的抑制作用12。但这种遗 传效应可持续几代以及高等细胞中是否也存在上诉现象尚不明确。位置效应。 研

10、究表明只有针对编码区的dsRNA才产生干扰效应，对内含子区域的ds RNA不产生干扰效应13Kesharwani等14根据人组 织因子(human tissue factor, hTF)的不同位置合成了 四组双链RNA分别观察其干扰效应，结果显示hTF167I和hTF37 2 1有8 5%90%的基因沉默效率，hTF 5 6 2 I只能抑制部分基因， hTF478I几乎无干扰效应。放大效应。通过实验研究发现，少量ds RNA就能够使大量目的基因沉默，即使细胞增殖50100倍，这种沉默 现象仍然存在，表明RNAi存在扩增机制.4. 1高度特异性当一段与基因同源的dsRNA注射入果蝇胚胎时，它可以

11、特异性 地在果蝇体内干扰靶基因的表达。而其他即使是与靶基因同属一个基因家族的基 因都不会受到干扰。4. 2高穿透性RNAi具有距注射点远距离作用的能力。在线虫中干扰效应甚至可 通过生殖系统传递到后代个体。4. 3高效率性RNA干扰作用是在目的基因被转录后，通过对细胞质中同源mRNA 的快速降解，最终由于该基因缺少mRNA而无法产生蛋白质产物。果蝇的RNAi 实验结果在23d即可以得到结果，这是其他传统实验技术所无法比拟的。4. 4高稳定性以3端悬垂，ri碱基的dsRNA尤为稳定，无需像反义核酸那样 进行广泛的化学修饰以提高半衰期。高特异性RNA选择性地引起靶基因mKNA的降解具有 高度特异性,

12、有时一个碱基改变就会大大降低靶基 因封闭效果,如Bnimmelkairip等利用载体表达的 small hairpin RNA(shRNA)来封闭人 MCF-7 细胞的 CDIII基因，shRNA上仅一对碱基的突变，就不能抑 制CDH1基因的表达.高效率在细胞内，RNAi途径一旦被启动，反应信号就 可以被一定程度地扩增和放大.有人认为，最低每个 细胞一份拷贝的lsK51A就可以封闭基因的效果. 3.3高成功率RNAi已被用于线虫全基因组的功能分析,研究 结果表明，其中50%80%序列选择有效,12.9% 27%的基因封闭产生了明显的异常表型(具体见卜 述RNAi的应用).RNAi的特征RNAi

13、具有如下董要特征1a. RNAi是双链 RNA介导的转录后基因沉默（PTGS）机制，在 此情况下，启动子是活跃的，外源基因也能被转 录，但不能正常枳鼠mRNA.当转基因细胞中存 在与外海基因同源的内源基因时，不但外漉基因在 转录后水平上失活，也诱导与之同源的内源基因沉 款：b.高稳定性.以3,端悬垂TT碱基的双链 RNA尤为稔定，无需像反义核数那样进行广泛的 化学修饰以提高半衰期口）c.高效率，能在低于 反义核酸几个数贵级的浓度下.使目标基因表达降 到极低水平甚至完全“剔除”，从而产生缺失突变 体表型：比基因敲除技术更快更简单,可以仅仅在 一周时间内关闭10个基因的表达，而且，那野在 胚胎中敲

14、除后导致死亡的基因,也可以利用RNAi 的方法在培养细胞中进行研究口。工人双干涉系 % 哺乳动物细胞中存在两条相互独立的“干涉” 途径，非特异性干涉反应，由30 bp长序列双链 RNA介导*可导致整个细胞非特异性蛋白合成抑 制及RNA降解：特异性干涉反应，由2125足的 小干涉RNA介导，可逃避非特异性干涉系统的 .监控，只降解与其序列相应的单个基因的 iuRnN3：高特异性：小干涉RNA除正义链3 端的两个域基在序列识别中不起主要作用外，其他 单个硬基改变就可能使RNAi失效，而针对同源基 因共有序列的RNAi则导致同源基因英同失点叫 f.高穿透静荤播Ai具有强大的细胞穿透能力，可RNAi干

15、涉的特点1、干涉导致转录后水平的基因沉默注射靶mRNA的内含子序列不会产生干涉效应，而且Die等RNAi 过程的美犍酣在细胞胞浆中的发现验证了这一观点.2,干涉特异性较高.单个碱基的改变即可导致RNAi的失效.可降解相对应单个的mRNA,即便是同一家 族的其他基因也不会受到影响巴同时也可特异性抑制同源基因的表达.3、干涉效果明显.微量的dsRNA就可以导致RNAi.而且效果十分明显,每个细胞仅需要几个dsRNA就 可产生个体水平的RNAi效应.mRNA降解速度很快，可以在几个小时内通过观察干涉的靶mRNA峰度来 验证试验结果.4、干涉途径广泛简单生物可通过电转化导入dsRNA,而多细胞生物或胚

16、胎可通过注射而达到目的.例 如:线虫可通过注射.展食叫浸泡达到目的.而在植物中可通过韧皮舒切割、也可在细胞内转录为双链RNA 的DNA嵌合结构，利用农杆菌转化而达到目的.同时基因枪法、电穿孔法四等也具有成药的报道,也有人利 用质粒携带模板DNA进行体内转录合成dsRNA来得成功.5、不能稔定遗传，只可将干涉效果影响至下一代，6、RNA可跨越细胞间界限.在线虫实验中，出RNA干涉可穿速细胞间界限.将dsRNA注射人头腔或尾， 靖祟可在远电离的组织甚至是后代的的血液中产生特异，有效的F涉现象,在植物中也有证实：在可自 植物切皮部而遍及扩散至整个植株叫将一个表面吸附有500bp基因片段灼金属片恬入桢

17、物.在侵入点周困万方数据第3期 王志伟等：RNA干涉的研究一展 129组织细电发生了同源基因表达的抑制,x 也就是说在植物中，共抑制效应可以由转染部位传递到其他细胞也 可以通过维管组纵长电离传递到整个植物体-当植株局部被病毒感染或嫁接后，RNA沉默信号可以被系统 的传递给整个植株叫siRNA的结构和功能之间存在相关性一LRNA 经过切割形成20 25nt的siRNA,它们具有5末端 的磷酸基3末端的羟基和2个突出的单链核苦酸。 这种结构对于RNAi是十分必要的。Nvkanen等的 研究表明平末端的&RNA或失去5,磷酸基团的 siRNA不具有RNAi的功能。所以，siRNA的三大 结构特征是：

18、长度为21 23、双链两端各有两个突 出的3,碱基、5,端有磷酸基团。这些特征使得siRNA 有别于其它的ckRNA,这也是细胞能够区分出 真正的siRNA和其它dsRNA的分子基础。基于 RNAi的这一特性，细胞可以自行监控异常的mR- NA,并封闭该基因的表达。RNAi的特异性。众多实验结果表明：导人生物 体的siRNA只能引起同源基因表达的抑制，而无关 基因不受影响&而且，在siRNA序列中配对的19. 21m中如果只改变一个核昔酸，就可以使该siRNA 序列不对靶inRNA起作用，证明RNAi有明显的特 异性。科学家可以通过制备外源性的siRNA并导 入细胞内，特异性地抑制某些基因的过

19、度表达和抑 制突变基因的表达，研究基因的功能。RNAi的高效性。ckRNA在DICER作用形成 siRNA,siRNA解链与RISC形成复合物，这些RISC 可专一性地与靶向的mRNA特异性结合。siRNA也 有可能不与RISC结合，而是通过解链直接靶向结 合inRNA不域然ISC结合位点或单链siRNA结合f立点在RdRP作用卜U形成疑的dsRMA,后为被 加CER特异识别而将tkRMA切断,形成新的点RWA 而再循环作用于靶向iiiRMA 切断后的mRNA或 被核酸外切酶所降解或可能成为异常RMA,在 R/RP作用卜又形成&RNA,再次被D1CER设别并 切断,形成新的日正NA进一步作用于

20、靶向,RNA. 这种不断放大的深布式作用形成大量新的回RNA、 使RN而作用在短时间内达到迅速并有效地抑制 hlRWA翻译形成蛋白质或亲肽.从而有效地抑制了 靶向基因蛋臼质或多肽的合成口，每个细胭只需 少量人RNA即能完全关冏相应基因表达，可见、 RNAi过程具有生物催化反应的基本特征“RNAi的可扩散性；R电等观察到将册RNA注 射于线虫体内,这些八RNA可以从注射处的细跑犷 散到体内其他细胞，引起其他细胞的基因沉默川匚RNAi的可遗传性初期的实验观察到.在华丽 新小杆线虫,果施和小鼠的实验可以看到，细胞增殖 50 KX）倍仍M保持RNAi演应这说明RNAi有 放大的效应,或者有高效的催化机

21、制口然而，虽然 RNA1的效应是长效的,甚至在受注射的华丽新小杆 线虫的子一代的整个生活周期里都能持续.但是由 于它并不能产生DNA的修饰,随着细胞的不断分 裂，小RN八逐渐被稀释，最终不能存续地遗传卜.去. 为了解决基因沉默的稳定性遗传问题小档rineideH 和THMmitimk值等发现发夹样结构的RNA时以在果 蝇体内诱导稳定遗传的RNAi.用转基因技术将反 式重叟的外源基闲导入果蝇体内，所表达的具有发 夹样结构的转录产物也熊实现基因沉默的槎定遗 传*RNAi有以下6个重要特性：高特异性。特异性地抑制目的基因。RNAi能够非常 特异地只降解与其序列相应的单个内源基因的mRNA。靶序列的选

22、择性。RNAi 的靶序列需要慎重选择，外显子序列的dsRNA能产生特异高效的基因抑制作用， 而只具内含子序列的dsRNA则无此效应。高效性。RNAi抑制基因表达具有很高 的效率，可以达到缺失突变表型的程度，而且相对很少量的dsRNA就能完全抑 制相应基因的表达。可传播和可遗传性。RNAi抑制基因表达的效应可以在不同 细胞间长距离传送和维持。在线虫中干涉效应可以传递给子代。较强的稳定性。 siRNA分子3端有突出的非配对碱基的双链分子，在细胞内可稳定存在34天， 半衰期远长于反义寡聚核甘酸.ATP依赖性。去除样品中的ATP, RNAi现象降低 或消失，显示RNAi是一个依赖ATP的过程，可能与D

23、icer和RISC的酶切反应必 须由ATP提供能量有关.1. 2特征。RNAi在转录后水平调节基因的表达，对染色体DNA序列的复制和 转录过程不产生任何影响。高度特异性：这是RNAi最大的特点，导入细胞的 dsRNA只特异性的抑制与RNAi同源的靶基因序列，siRNA中只要有任何一个碱基 与靶序列错配，也会明显减弱干扰效应口。高效性：相对较少的dsRNA就可 以达到明显的抑制基因表达的效果，引起该基因的表型缺失突变。浓度、时间 依赖性：RNAi效应存在时间、浓度双重依赖性，干扰效应常出现在注射dsRNA 后6h,在注入dsRNA的23 d后作用最强，可持续效应72 h以上，而其干扰 强度则随着

24、浓度的增高而增强。传递性和遗传性：将dsRNA注射于线虫体内 后发现，dsRNA可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持， 并引起其他细胞的基因沉默，表明了 RNAi作用的可传递性。同时也发现，siRNA 介导的RNAi具有一定的可遗传性。将dsRNA注入秀丽新线虫的性腺后，在其子 代中也诱导出了同样的基因抑制现象，即证明了它的遗传性。高序列特异性RNAi是转录后水平的基因沉默机制，有高度的序列特异性，19 nt的dsRNA几乎 可以完全抑制基因的表达，而将其中的1nt突变掉后，它对基因的抑制作用就消 失了，这种高度的序列特异性能够使dsRNA能够非常特异地诱导与之序列同源 的

25、mRNA降解，避免降解与目的mRNA同家族的其他mRNA,从而实现对目的基 因的精确沉默。因此，RNAi具有重大的医学价值。高效性RNAi存在级联放大效应，由于Dicer酶切产生的siRNA与同源mRNA 的结合并降解后者，产生新的siRNA ；新产生的siRNA可再次与Dicer酶形成RISC 复合体，介导新一轮的同源mRNA降解的多次利用，如此循环，使相对很少量 的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能产生强烈的RNAi效应（每 个细胞仅需几分子siRNA就可产生RNAi效应），并可达到缺失突变体表型的程度。 相比普通的siRNA,具有短发卡结构的双链RNA （ short

26、hairpin RNA, shRNA）产生的 RNAi效应更强。RNAi抑制作用迅速RNAi基因的表达发生在转录后，通过细胞质中同源mRNA 的快速降解，最终使该基因缺少mRNA而无法产生蛋白质产物。RNAi作用的靶基因位点有选择性外源性dsRNA的转入只对成熟mRNA的产 生作用，对mRNA前体没有或很少具有影响，以内含子或启动子序列构成的外源 dsRNA无法引起RNAi效应。具有高稳定性与反义寡核甘酸不同，siRNA是3端悬挂TT碱基的双链RNA, 所以化学性质很稳定，无须象反义核甘酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期。 3.6可传播性和可遗传性RNAi抑制基因表达的效应可以越过细胞界限，

27、在不同 的细胞间长距离传递和维持。在线虫中干涉效应可以传递到子代，但这种遗传只 限于子一代，子二代往往又恢复到野生型。3.7 RNAi效应的依赖性只有连续输入 dsRNA,沉默效应才能持续下去，否则将产生短暂的沉默反应，而且这种效应的 强度与初始dsRNA的浓度有关。2. RNAi的特点高度特异性：有时siRNA 一 个碱基改变就会大大降低封闭靶基因的效果口 Brum- melkamp等上利用载体表达的小发夹RNA ( small haupm RNA, shRNA)来过闭入 MCF-7细胞的 CDH1基因，shRNA上仅一对碱基的突变就不能抑制 CDH1基因的表达。其中.siRNA的中央位置碱

28、基位 点和3,末端倒数第2个碱基起了特别重要的作用小 (2)高效率口;：在细胞内RNAi途径一旦被启动，反应 信号就被放大.在低等动物中靶基因表达抑制效率大于90%,甚至有人认为每个细胞一份拷贝的 心R- NA就可以达到封闭基因的效果。(3)高成功率： RNAi已被用于线虫全基因组的功能分析.其中有 50%80%序列选择有效，12. 9%27%的基因封闭 产生了明显的异常表型.例)种属时效性rie等k发 现，在低等生物中RNAi可持续存在，但RNAi在哺 乳动物细胞中只能维持一段时间，一般注入dsRNA 后的23d,RNAi的作用最明显，而后12d内，靶 mRNA的丰度就能恢复到注射RNAi之

29、前的水平， 这可能是由于RNA依赖的核首脱氨防脱氨基活性的 逐步增高，导致siRNA的生成减少而受到抑制。(5) lMRNA的长度限制性：Dic能与200-500m范围内 的dsRNA结合，底物片段越短，Die*酶的活性也就 越弱，提示RNAi具有dsRNA片段长度限制性。(6) RNAi的遗传性：目前已有大量的资料证实,在低等生 物中RNAi可以传代，线虫中的RNAl遗传性需要 Rde-1和Rde-2来后动C7)传播性：RNAi效应可 以在细胞间扩散，最近Van等研究发现，sid 1基因可 编码一种能跨膜11次的蛋白可能与此现象有关. (8)ATP依赖性：在去除ATP的样品中，RNAi现象

30、降低或消失，显示RNAi是一个ATP依赖的过程,可 能与Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能 量有关.(9)模板选择性：RNAi只有效作用于外显 子，而对内含子无影响中ikRNA序列是某个基因的 启动子序列时也没有明显的效应.另外，RNAi对稳 定且丰富表达的靶基因抑制效率也不高.RNAi是转录后水平的基因沉默机制。注射该基因的内含子或启动子序列的dsRNA 都没有干涉效应。翻译抑制剂对RNAi不产生影响。RNAi具有较高的特异性。起 初人们认为RNAi和siRNA的产生可能是序列非特异性的因为Fire和Mell发现将 化学合成的dsRNA注入线虫体内，只要当dsRNA大于26bp

31、时就会发生RNAi， 而dsRNA阻断基因表达的效能与其长度呈正相关，并且不包含腺嘌吟，尿喘啶， 或胞喀啶的dsl矶A也可诱发RNAi。但实际上dsRNA发挥干扰作用时对序列相 关性要求还是有较高要求的，序列不同的dsRNA与目标基因mRNA要求它们相 同的连续序列长度大于30. 35nt,目标基因方可被抑制，而当该长度为1423nt 时抑制效率是非常低的，这些结果显示，使用长的dsRNA或是两相关序列90% 同源时基因抑制将会发生。而另一方面，slRNA若不与mRNA结合其自身又是不 稳定的，易于降解。这一稳定性提供了快速的特异性筛选，即不论何种来源的 dsRNA若细胞内没有与其互补的可供抑

32、制的mRNA序列与之结合，由于它的不稳 定性，接下来的反应不能继续进行，反应被终止。而若是有可结合的互补mRNA 反应则继续进行。这些均说明siRNA抑制基因表达是具有序列特异性的。RNAi抑制基因表达具有高效性。极少量的dsRNA就能有效地抑制靶基闪的表达， RNAi是通过自身放大机制来发挥作用【l弓I，但dsRNA需要一个最小的长度才能 产生有效的干扰效果。dsRNA小片断如果小于21. 23nt,特异性将明显降低，不 能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21. 23nt,互补序列可能 延伸，超出抑制范围。RN加有浓度，时间双重依赖性。干扰效应通常出现在注 射dsRNA6小时后，

33、可持续72小时以上。RNAi基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递 和维持，并可传递给子一代。RNAi是生物基因组削弱或抵抗外来遗传讯息入侵的保护性机制，已成为近年来 研究基因功能、肿瘤治疗的新方法，该技术具有以下重要特征：高效性和浓度 依赖性(Schneider et al, 2005),只需要少量的siRNA就可以引发RNAi现象。这是 因为整个过程中存在倍增放大机制。Martens等在网状原虫的RNAi试验中敲除 RrpA(RdRP的同源体)后则无法检测到siRNA,但在体外系统中仍可检测到，且量 非常少(Martens etal, 2002)；高特异性，siR

34、NA具有高度特异性，只针对某一 目的RNA或是其同源序列发挥作用。而对其他基因或是相关基因序列并没有沉 默作用，这也是RNAi最大的优点，针对性强。此外与基因敲除相比，根据目标 基因设计合成的siRNA具有高度特异性，不同siRNA对同一基因的沉默效果不同， 从而可以模拟数量遗传性状；可遗传性，将siRNA植入生物体内，从根本上改 变了这种生物的基因组成。因此具有遗传性。Fire等(1998)做过相关试验。将针 对某基因的siRNA注入线虫的性腺后在其子代中同样检测不到该基因的表达。通过对植物拟南芥）、动物（线虫和灵蝇）等 的RNAl现象的研究,不难发现RNAi作用具有以 下重要特点,首先,R

35、NAi具看高度的特异性.只 引起与小RNA同源的mRNA降解口 RNAi技术 中siRNA序列选择余地大，21可3个核甘酸中只 要改变一个核甘酸，就可以使该台iRNA序列不对 靶向mRXA起作川+因此RNAi可用来抑|制单个 核甘酸突变基因的表达，其次,RNAi抑制基因表 达具有很高的效率,仅需少量的dsRNA就能有效 抑制阳基因表达. V-mX.研究发现要达到相同 的抑制J连环单门基因的目的应义穿核背酸技 术所需浓度为2 RmM/L,而aiRNA则仅需要2。 nmol/L（ Aoki 爪）叫 此外,RNAi具有系统性 （或可传播性人即siRNA灯以在RNA依赖性 RNA橐合醉的作用下进行大量

36、扩增，并转运出期 胞,使RNAi扩散到整个机体并可以传代二?1正因 为如此，TAl技术迅速发展成为- -种功能强大 的研究哺乳动物中选择性抑制特异性灵因表达和 研究基因功能的重零方法,加快功能基因组学领 域的研究步伐国二2 RNAi的作用特点(1)高度将异性:有时期&NA一个麒基改变就会大大降低封闭靶基因的效果口高效率: 在闱胞内RNAi途径一旦被启动,反应信号就被放大.在低等动物士肥基因会尘抑制效率大于 为沏甚至有人认为每个细泡一倍拷贝的小KNA就可以达到封闭基囚的效果，(3)高成功 率:RNAi已被用于线虫全基因组的功能分析淇中有50%典%序列选择有效,12?%27%的 基因封闭产生了明显

37、的异常表型.(4)种属时效性:1加等网发现,在低等生物中RNMH持续 存在，但RNAi在哺乳动物钿胞中只能维持一段时间股注入心RNA后的d3d ,K5A用作用 最明显，而后12d内.靶mRNA的丰度就鸵吸复到注射RMM之前的水平.这可能是由于RNA 依梭的核俘脱敏酸脱氮基活性的逐牛增莅导致siKNA的生成减少而受到抑制L (习由&NA的 长度限制性;Die叮能与加。范用内的出RNA结合,底物片段雄矩,Dictr雷的芯性也就越 弱次-示RNAi具西欧RNA片段长度限制性，RNAi的遗作性后前已有大墩的资料证实，在巴 等生物中时闻工以传代，线虫中的RNAi遗作性需要艮加-1和Rde-2米启动，(7

38、)吨播性：RNAi 效应可以在纲跑间扩散渴近Van等研究发7L证/基囚圮绸葩一种能蒋膜I1次的蛋宜可能与 此现象有关.患)ATP依赖性;在去除ATF的样品中,RNAU见象降低或消失，显示RHAi是一个 ATP依赖的过程;可能与口族称RI&C的醇切反庖必须由ATF提供能量有关。模板选择性: RNA；只有效作用于外显子，而对内含子元建前.dsRWA序列是某个甚因的点动子序列时七 没有明显的效应.另外，处AIM稳定且丰富表达的和延因抑制效率也不高.2 KNAi的生物学特点韩异柱RNAi是转录后水平的基因沉默机制,有高度的序列特异性，这使dsRNA能够非常特异地诱导与之 序列同源的mRNA降解.避免降

39、解与目的mRNA同 家族的其它mRNA,从而实现对目的基因的精确 沉默.口2-2 选择感外源性击RNA的转入只对成熟mRNA产生作用，对mRNA前体没有或很少具有影响，以内含子 或启动子序列构成的外源dsRNA无法引起RNAi救应MsRNA的长度对RNM的效率有影响。高效性只需少量壶RNA的引入便可抑制浓度是几倍 甚至几十佛的闺RNA的降解木、可能的原因： RNAi存在级联放大效应。相比普通的siRNA, shRNA产生的RNAi效应更强;可能与RdflP的 作用有关，即在R&RP的作用下，曲RNA得以复制，从而产生更多的矗RNA导致mRNA降解， 2.4 可传辑性和可遗传性RNAi抑制基因表

40、达的效应可以越过细胞界限， 在不同的细胞间长距嚣传递和维持口值得注意的 是，大于30 nt的也RNA在哺乳动物细胞中可产生 非特异的基因抑制效应，其可诱发细胞内的干扰素 系统，激活RNA依赖蛋白激幅PKR,使翻译起始因 子2的亚基（EIF2h）被磷酸化，导致翻译过程被阻 断，同时激活RNA防配体（RN配乩），语导干扰素的 产生，从而抑制蛋白质的合成，导致细胞阖亡河口 然而，在胚胎干细胞或畸胎癌细胞系中不存在这种 干扰素效应，长的点RN仍可引起基因特异性的 RNAL抑制作用迅速RNAi基因的表达发生在转录后通过细胞质中 同源mRNA的快速降解，最终使该基因缺少mRNA 而无法产生蛋白质产物口稳定

41、性较强siRNA分子式3,端有突出的非配对碱基的双犍 分子,在细胞内可稳定存在3 -4d,半衰期远长于反 义寡聚核昔酸。2r7操作简单较之传统的技术难度高、费用高.试验周期长的 探针杂交、基因敲除等方法，RNA干扰技术操作相 对简单，效果明显凸另外，RNAi还有对靶mRNA的 切割位点确定性和高穿透性等特点口2.2 RNAi的特点 RNAi较反义寡核苜酸核酣，基因敲除等技术有着无可比拟的特点和优势:（I）高效性:少量的URNA可以显著抑制目的基因的表达，具有催化放大效应：（2 ）高特异性：RNA1只降解同源mR、A,而其他mRA的表达则不受影响；（3 ）传播,住二RAi具有强大的细胞穿透力,抑

42、制效应可以穿过|细胞界限，干扰效应可遗传给后代；G）ATP依赖性二RNAi的发生依赖于ATP的参与.因为在Dicer的将 dsRNA切割成siRXA过程及RISC过程均需要ATP 的参与事3. 1高效性注入细胞内的siRNA的量比细胞内的mRNA量要少得多。但因为其自身的循环放 大机制仍可对目的基因产生有效的阻断。3. 2高特异性由dsRNA降解成的小的干扰RNA,除其正义链3 7端的两个碱基在序列识别中不 起主要作用以外，其余碱基在序列识别中都是必需的。单个碱基的改变即可以使 RNAi失效，RNAi能特异性降解mRNA,针对同源基因共有序列的RNAi则可使同 源基因全部失活。3. 3共抑制性

43、RNAi是由双链RNA介导的转录后基因沉默机制，它的启动子相当活跃，外源基 因可以转录，但不能正常积累mRNA。RNAi作用不仅使外源基因在转录后水平上 失活，同时诱导与其同源的内源基因沉默。3. 4种属时效性Irie等发现在低等生物中RNAi可持续存在，但RNAi在哺乳动物细胞中只能维持 一段时间，一般注入dsRNA后的23 d, RNAi的作用最明显，而后12 d内， 靶mRNA的丰度就能恢复到注射dsRNA之前的水平。这可能是由于RNA依赖的 核甘脱氨酶脱氨基活性的逐步增高，导致siRNA的生成减少而受到抑制。3. 5 dsRNA的长度限制性Dicer酶能与200500 bp范围内的ds

44、RNA结合，底物片段越短，Dicer酶的活性 也就越弱，提示RNAi具有dsRNA片段长度限制性。Z R YAi的作用旃点RN&技术与以往其他基因于犹技术楣比有如下将 点口.工口通可加是#RMA介导的转录后水平的基因沉默 TTG於机制. (与高稳定性，以/端突HI TT戚基的#RNA 尤为稳定，无需象反义核酸那样进行广泛的化学修饰以提高半 套期力高度专-拄，即#RNA具有高度的特异性，它只能 引起与亚RNA同源的基因表达活性大幅度降低，即RM/Vi有 同源基因依赖性，：SiRNA除正义链3端的3个碱基在序列谭 别中不起主要作用外,其他单个喊基改变就可能使RNAi失 效，.而针对同源基因共有序列

45、的RNAi则导致同谯基因共同失 活, 高皴性，RNAi机制中存在催化或放大的步骤少曼的 次RNA分子就能完全扪制相府基因的表达，能任低于反义核 苜酸儿个数昆皱的液度卜研究目桃基因。比基因微除更简单， 更快捷而且，邨些在胚胎中敲除后导致死亡的基因,也可以 利吊RMAi的方法任培养细胞中进行研究.(5)双干扰系统, 啃扎动物细胞中存在两条相互独立的干扰”途径；非特异性干 扰反应和特舁性干扰反应。非特异件干扰反同由蓟bp序列 的亲RNA介导，可导取整个细胞非特异蛋白合成抑制及RNA 降解三特异性干扰反应是由幻-23nt的由心A介导可逃避 非特异性干扰流统的监控，只能降解与其序列相应的单基因的 eRM

46、A高穿透性“RM%抑制基因表达的效应可以穿过 细胞界限，任不同钿胞间上距离传逸和维持。在皤里中干扰效 应甚至可以传到后代去。C)RNAi过程中需要ATP参与功 弗，f的RNAi作用的靶整因位点有选择性.许多寞骐研完结 嘉显示RNAi作用对靶位点有选择件 一般认为对内含子和启 动不序列无靴“有时即使是外思不的某些位点也不理想，对此 目前还不充全清楚.RNA干扰(RNA interference, RNAi)是生物基因组抵抗病毒或转座子之类 的外来遗传元件入侵的一种保护性机制，RNAi具有4个重要特征11： (1)高 效性：少量的双链RNA (dsRNA)就可以使相应的基因表达受到抑制，即其发 生

47、过程中有正反馈的信号放大效应；(2)高特异性：双链RNA (dsRNA)可以 特异地降解与之序列相对应的单个内源基因的mRNA,无关基因不受影响；(3)可 遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的效应不仅能够传递给子一代，而且可以 在同一个生物体的不同细胞甚至生物体间进行长距离的传递和维持；(4)ATP依 赖性:RISC的形成和Dicer酶切割d sRNA的过程中都需要ATP的参与；因此， RNA干扰想要发生效应则必须要依赖ATP的参与。3. 1高序列特异性RNAi是转录后水平的基因沉默机制，有高度的序列特异性， 19 nt的dsRNA几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的1 nt突变后，它对基

48、 因的抑制作用就消失了，这种高度的序列特异性能够使dsRNA非常特异地诱导 与之序列同源的mRNA降解，避免降解与目的mRNA同家族的其他mRNA,从而 实现对目的基因的精确沉默。因此，RNAi具有重大的医学价值。3. 2高效性RNAi存在级联放大效应，由于Dicer酶切产生的siRNA与同源mRNA 的结合并降解后者，产生新的siRNA；新产生的siRNA可再次与Dicer酶形成RISC 复合体，介导新一轮的同mRNA降解的多次利用，如此循环，使得相对很少量的 dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能产生强烈的RNAi效应，并可达 到缺失突变体表型的程度。3. 3 RNAi抑制作

49、用迅速RNAi发生在转录后，通过细胞质中同源mRNA的快速降 解，最终使该基因缺少mRNA而无法产生蛋白质产物。3. 4 RNAi作用的靶基因位点有选择性外源性dsRNA的转入只对成熟mRNA产生 作用，对mRNA前体没有或很少有影响，以内含子或启动子序列构成的外源 dsRNA无法引起RNAi效应。3. 5具有高稳定性与反义寡核甘酸不同，siRNA是37端悬挂rI-I.碱基的双链 RNA,所以化学性质很稳定，无须像反义核甘酸那样进行广泛的化学修饰以提高 半衰期。3 RNA干抗的特点3A 靶向速择性根据目的基 因结构设计的不同川RNA所产 生的效应存在显著差异，这种作 用仅针对靶向基因的外显子序

50、 歹IJ,而对启动子或内含子序列没 有效应心3.2件异性玳RNA只能引起 同源基因表达的抑制，而无关基 因不受影响口而且在siRNA序 到中，配对的19-21nt中如果只 改变一个核昔酸.就可以使该 siRNA序列不对靶mRNA起作 用，证明RNAi有明显的特异 性口33 高蚊性在mRNA的降解 过程中，不断形成大量的新 siRNA, RNAi作用在短时间内 迅速有效地抑制mRNA翻译形 成蛋白质或多肽,从而有效地抑 制靶向基因蛋白质或肽的合成， 每个细胞只需少量d丽NA就能 完全关闭相应基因的表达口可 见，RNAi过程具有生物催化的 高效性。高超定性 siRNA作为 RNA干扰过程中关键的效

51、应分 子，是由正义链和反义链组成的 长约21-23m的特殊dsRNA分 子,正义链序列与所作用的靶向 mRNA具有同源性,正义链和反 义靛末端均为5,端礴酸和余端 兵基，而且均有23个突出的非 配对碱基,在细胞内可稳定存在遗传性虽然RN加的效 应是长效的，但是由于它并不能 产生DNA的修饰随着细胞的 不断分裂,dgRNA逐渐被稀释， 最终不能持续地遗传下去a而 KsncnlM等发现发夹样结构的 RNA可以在果蝇体内诱导稳定 遗传的RNA干扰口用转基因技 术将反式重复的外源基因导入 果蝇体内,所表达的具宥发夹样结构的转录产物也能实现基因 沉默的稳定遗传口3,6长度和浪度依麓性大量 资料显示，蒙的

52、小RNA比短的 dsftNA介导的RNAi更有效， 但是这种活性作用与曲RNA 长度的增加之间没有严格的正 比关系台同样的，RNA干扰效应 随siRNA浓度的增高而增高, 但达到一定浓度后效应不再增 加3.7嗡乳动物体内的RNAi具 有独特性与果蝇、线虫，植物 不同，哺费动物体内的占iRNA 不具有扩增效应而且围RNA 长度的改变可以引起不同机制 的干涉效应口大于30nf的 dsRNA所引起的非特异反应，可 导致整个细胞非特异性蛋白合 成抑制和RNA降解”而21-23 的短双鞋RNA则只降解同源基 团的inRNAp3特异性RNAi是转录后水平的基因沉默机制，有高度的序列特异性，这使出RNA能幡

53、非常特异地诱导与 之耳列同源的mRNA降解，避免降解马口的而tNA同家族的凡它mRNA,从而实现对Fl的基因的精 确沉默町12选择性外源性dsRNA的转入只对成熟mRNA产生作用，对mRNA前怵没有或很少具有影响，以内含 子或启动子序列构成的外海d尔NA无法目I超RNAi效国dsRNA的长度时RNAi的效率有影响.3.3高效性R需少量本心的的引入便可抑制浓度是几倍甚至几十倍的mRNA的降解限6。叮能的原因卜RN Ai存在级联放大效应L相比普通的5IRMA.占hRKA产生的ENAi效应更强；可能与RdRP的作用 有关，即在RdRP的作用下，d蛆NA得以良制.从而产生更多的dsRNA导致iliRk

54、a降解3可传播性和可遗传性RNAi抑制基因表达的效应可以越过细胞界限，在不同的细胞间长距离传递和维持.值得注意的 是，大千前肩的的RNA在哺乳动物邳胞中可产生非特异的基因抑制效应，其可隘发班胞内的干扰素 系统.搬活RNH依赖蛋白微MPKR,使翻洋起始因子7的3亚基（EIF上。被璘酸化，导致翻译过程 被阻断，可时激活RNA酶配体LRN居立上诱导干扰素的产生，跳而抑制重白质的合成，导致珈胞调 亡3L然而，在胚胎干细胞城畸胎癌细胞系中不存在这种干扰素妓应，长的dsRNA仍可引起基因特 异性的RNLAi,*5抑制作用迅速皿Ai基因的友这发生在转录后.通过细胞质中同萧mRNA的快速降解.最绛使液基因缺少

55、ink NA而一无法产生蛋白质产物。3再稳定性较强siRN在分子式9端有突出的非配对碱基的双薛分子，在郛胞内可稳定存在於阻，半我期远长于反 义宴聚核甘酸.茶7操作简单较之传统的技术雄度高、费用高、试蜡周期性的探针杂交、基因敲除等方法，艮NA干扰技术操作 相对简单，效果明显口另外，R因Ai还有对靶uiRKA的切割位点确定性和高穿透性等特点。3. 1序列上的高度特异性：siRNA与靶基因的mRNA在序列上严格遵循碱基配对 原则，这样就能特异性地干扰靶基因表达，而和靶基因同属一个基因家族的其他 基因则不会受到影响。3. 2抑制基因表达的高效性：RNAi对基因表达的抑制率 可达90%以上，而且仅需极少

56、量的dsRNA就能产生强烈的RNAi,这种极高的抑 制效率是传统实验技术所无法媲美的。3. 3化学性质的高度稳定性：由于siRNA是在3端带有2个TT碱基的dsRNA, 所以化学性质非常稳定，不需要通过广泛的化学修饰来提高半衰期。3. 4 RNAi抑制作用的迅速性：RNAi能快速降解胞质中的靶mRNA,从而使靶基 因无法产生蛋白质产物，达到沉默靶基因的目的。3. 5 RNAi效应的依赖性旧J：沉默效应只有连续输入dsRNA才能持续下去，而 且dsRNA的初始浓度影响RNAi效应的强度。3. 6 RNAi效应的可遗传性和高穿 透性：dsRNA可通过质膜、细胞间隙和细胞屏障而转运，并能在不同细胞或

57、生物 间长距离传递和维持，甚至可传给子代（线虫）。2.4 RNA干扰的遗传稳定性 向已等巴观察到注射下线虫 体内的也RN八可以从注射处的细胞扩散到体内其他细胞，引 起尺他细胞.的基因沉默。虽然RNAi是长效的，其至在受注 射线虫子一代的整个生活周期里都能持续，但是由于它并不 能产生DN4的修饰，随着细胞的不断分裂，也HXA逐渐被稀 释,最终不能持续地遗传下去,为了解决基因沉默的稳定性 遗传问题,利用转座子的反向重复序列产生由RWA发卡，这 种发夹样结构可以启动FTCS效应，从而抑制转座酶量白的 产生和转座子的移动，有利于遗传稳定，防止遗传损害.用 转基因技术将反式重复的外源基因导入果蝇体内，所

58、表达的 具有发夹样结构的转录产物也能实现基因沉默的稳定 遗传小飞3. 1 RNAi是转录水平的基因沉默只有针对mRNA的基因沉默才是有效的。以内 含子为靶向的RNAi无干扰效果。3. 2高特异性RNAi是以siRNA为导向，对与siRNA互补的mRNA发挥干扰作用 的。siRNA通常只有2125bp,外源导入的siRNA最长有报道29bp的。只有在 siRNA与靶基因完全互补配对的情况下，RISC才能发挥作用，一个碱基的突变都 可能导致干扰失效。又由于并非所有的mRNA位点都可以被siRNA干扰阻断，受 体结合位点和二级结构都会影响RNAi效果，不当的结合位点常常导致干扰无效 24, 25。通

59、常一段siRNA只能干扰一种或一类基因，因此具有高特异性。3. 3高效性通过对RNAi的机制的了解可以看出，一个起始siRNA在与靶基因结 合后即可以在RISC作用下把靶基因降解成大量新的RNA片段，自身又可以在RDR 的作用下复制扩增，形成干扰回路，使干扰效果成指数倍增长。3. 4系统性在植物中，RNAi信号可以通过胞问连丝和筛管进行细胞间短距离和 长距离的传递，从而是干扰扩散到整个组织或植株。动物细胞中RNAi信号可以 在相关跨膜蛋白介导下形成跨膜通道，达到扩散效果。线虫中发现的由sidl 基因编码SID. 1蛋白即是一种与沉默信号相关的跨膜蛋白26。哺乳动物中也发 现有SID. 1蛋白同

60、源物15。病毒引起的外源RNAi甚至是可以遗传的。RNAi 引导和控制的组蛋白修饰及异染色质状态也被认为可以遗传。3. 5显效快对哺乳动物细胞注入siRNA,在数分钟内即可发现干扰现象，在2. 3h 是效果最为显著。通常在1-2d后干扰现象完全消失。通过病毒载体介导RNAi, 可以使干扰效果持续lm。3。l RNAi现象具有种族特异性Barstead等16在dsRNA转染实验中发现，未分 化胚胎干细胞RNAi现象明显，而分化胚胎细胞中则不明显或仅能检测到微弱的 效应。Miyagishi等111利用u6启动子合成3末端4个尿甘酸突出的siRNA基 因沉默，实验证实siR. NA效应依赖于靶序列，