食品安全国家标准 水产品中河豚毒素的测定

1、 食品安全国家标准 水产品中河豚毒素的测定1范围本标准规定了水产品中河豚毒素的测定方法。本标准第一法适用于鲜河豚鱼的肌肉、肝脏、皮肤和性腺组织中河豚毒素（tetrodotoxin，简写为TTX）的测定。第二法适用于河豚鱼、织纹螺、虾、牡蛎、花蛤及鱿鱼中河豚毒素的测定。第三法适用于鲜河豚鱼中TTX的测定。第四法适用于河豚鱼中肌肉、肝脏、皮肤中河豚毒素的测定。第一法 液相色谱-串联质谱法2原理试样经1%乙酸甲醇提取，免疫亲和柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。3 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。3.1 甲醇（CH3OH）色谱纯。3.2

2、 乙腈（CH3CN）色谱纯。3.3 甲酸（HCOOH）色谱纯。3.4 乙酸（CH3COOH）优级纯。3.5 乙酸铵（CH3COONH4）色谱纯。3.6 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）。3.7 磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）。3.8 氯化钠（NaCl）。3.9 氢氧化钠（NaOH）。3.10 1%乙酸-甲醇溶液：量取10 mL乙酸（3.4），用甲醇定容至1000 mL。3.11 2%乙酸-甲醇溶液：量取10 mL乙酸（3.4），用甲醇定容至500 mL。3.12 0.1%甲酸溶液：量取0.1 mL甲酸（3.3），用水稀释并定容至100 mL。3.13 0.1%甲酸溶液（含5 mmo

3、l/L乙酸铵）：取0.5 mL甲酸（3.3）和0.19 g乙酸铵（3.5），用水溶解并定容至500 mL。3.14 0.1%甲酸-乙腈溶液（1：1，体积比）：取50 mL 0.1%甲酸溶液（3.12）加到50 mL乙腈中，混合均匀。3.15 磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，0.05 mol/L）：称取磷酸氢二钠6.45 g（3.6），磷酸二氢钠1.09g（3.7），氯化钠4.25 g（3.8），用超纯水溶解并定容至500 mL。3.16 氢氧化钠溶液（1 mol/L）：准确称取20 g氢氧化钠（3.9），用水溶解并定容至500 mL。3.17 河豚毒素标准品（tetrodotoxin，分子式C11

4、H17N3O8）：纯度98%。3.18 标准溶液配制3.18.1 河豚毒素储备液（100 g/mL）：准确称取河豚毒素10.0 mg（3.17），用少量0.1%甲酸溶液（3.12）溶解后以甲醇（3.1）定容至100 mL，-18以下避光保存。3.18.2 河豚毒素中间液：准确量取河豚毒素标准储备液（3.18.1）适量，以0.1%甲酸乙腈溶液（3.14）稀释成1 g/mL的标准中间液，-18以下避光保存。3.18.3 标准曲线工作液：准确量取河豚毒素标准中间液适量（3.18.2），以0.1%甲酸乙腈溶液（3.14）稀释得到11000 g/L的标准系列工作液，现用现配。3.19 免疫亲和柱：含河豚

5、毒素特异性抗体的免疫亲和柱，3 mL。28储存，使用前需回至室温。3.20 0.2m微孔有机相滤膜。4 仪器和设备4.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪：配电喷雾离子源。4.2 分析天平：感量为0.1 mg和0.01 g。4.3 均质机：转速10000 转/分钟。4.4 涡旋振荡器。4.5 高速冷冻离心机：转速8000 转/分钟。4.6 超声波清洗器。4.7 固相萃取装置。4.8 氮吹仪。4.9 pH计。5 分析步骤5.1 试样制备 用蒸馏水清洗鱼体表面的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后用剪刀将鱼体分解成肌肉、肝脏、皮肤和性腺（精巢或卵巢）等部分，各部分组织分别用蒸馏水洗去血污，滤纸吸干表面的水分后

6、将各组织剪碎，充分均质（4.3），装入清洁容器内，并标明标记。5.2 试样提取 称取5.00 g（精确到0.01 g）（4.2）匀浆试样于50 mL具塞离心管中，加入11 mL 1%乙酸-甲醇溶液（3.10），涡旋振荡2 min（4.4），50水浴超声提取15 min（4.6），以8000 r/min离心5 min（4.5），转移上清液于25 mL比色管中。在残渣中再加入11 mL 1%乙酸-甲醇溶液（3.10），重复以上步骤，上清液并入25 mL比色管中，用1%乙酸-甲醇溶液（3.10）定容至25 mL。移取约10 mL提取液至另一50 mL具塞离心管中，-20下冷冻30 min，再以800

7、0 r/min离心5 min（4.5），准确移取5 mL上清液，加入20 mL PBS溶液（3.15）进行稀释，用1 mol/L氢氧化钠溶液（3.16）调节稀释后的溶液pH在78范围内（4.9），待上样。5.3 试样净化 将免疫亲和柱中封存的PBS溶液以自然流速放出，移入样品溶液，保持样品溶液以1滴/s的流速过柱，再用10 mL超纯水淋洗，抽干，用5 mL 2%乙酸-甲醇溶液（3.11）洗脱于玻璃离心管中，洗脱液于45氮气吹干（4.8），加入1.00 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液（3.14）溶解残渣，超声1 min（4.6），过0.2 m滤膜（3.20）后，供液相色谱-串联质谱（4.1）分析。

8、5.4 仪器参考条件5.4.1 液相色谱参考条件：a）色谱柱：TSK-gel Amide-80，150 mm 2 mm （i.d.），5 m，或相当者。b）流速：0.3 mL/min。c）柱温：40。d）进样量：10 L。e）流动相：A为0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸铵）（3.13），B为乙腈（3.2），梯度洗脱程序见表1。表1 流动相梯度洗脱程序时间 （min）A （%）B （ %）0.010902.010902.190106.090106.18.0101090905.4.2 质谱参考条件a）离子源：电喷雾源（ESI）。b）扫描模式：正离子扫描。c）喷雾电压：4800 V。d）鞘气

9、流量：12L/min。e）辅助气流量：2L/min。f）离子传输管温度：350。g）源内碰撞诱导解离电压：10v。h）扫描模式：选择反应监测（SRM）。i）Q1半峰宽：0.7Da。j）Q3半峰宽：0.7Da。k）碰撞气压力：氩气，1.5mTorr。l）选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2。表2 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量目标化合物母离子（m/z）子离子（m/z）碰撞能量（CE/ev）河豚毒素（TTX）320162*3930225*代表定量离子5.5 标准曲线的制作将标准系列工作液（3.18.3）分别注入液相色谱-串联质谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面

10、积为纵坐标，绘制标准曲线。5.6 试样溶液的测定将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中河豚毒素的浓度，平行测定次数不少于两次。5.6.1 定性测定在同样测试条件下，试样溶液中与标准溶液中河豚毒素的保留时间之比，偏差在2.5%以内，且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相近的标准工作液中离子的相对丰度一致，其丰度比偏差应符合表3要求。表3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20%至50%10%至20%10%允许的相对偏差20%25%30%50%5.6.2 定量测定取试样溶液和相应的标准溶液等体积进样测定，采用标准曲线进行外标法定量。标准溶液及

11、试样溶液中河豚毒素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。河豚毒素标准溶液总离子流图参见附录A。6 空白实验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。7 分析结果的表述试样中河豚毒素的含量按公式（1）计算，计算结果需扣除空白值： （1）式中：X样品中河豚毒素含量，单位为微克每千克（g/kg）；c由标准曲线方程计算得到的样品净化溶液浓度，单位为微克每升（g/L）；V试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；m试样质量，单位为克（g）；f稀释因子，按照5.2步骤进行样品前处理时为5。以重复性条件下获得的两次独立测XX果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。8 精密度在重复性条件下获得的两次独立测XX果的绝

12、对差值不得超过算术平均值的15%。9 其他方法检出限为1 g/kg，定量限为3 g/kg。第二法 液相色谱-荧光检测法10.原理试样中含有的河豚毒素采用酸性水溶液提取，提取液经磷酸盐缓冲溶液复溶，经调pH至6.07.0后，过免疫亲和固相萃取小柱净化，液相色谱-柱后衍生荧光法测定，保留时间定性，峰面积外标法定量。11.试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。11.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。11.2 甲酸（CHOOH）：色谱纯。11.3 乙腈（CH3CN）：色谱纯。11.4 乙酸（CH3COOH）：色谱纯。11.5 乙酸铵（CH3COONH4）：

13、色谱纯。11.6 十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）。11.7 二水合磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）。11.8 氯化钠（NaCl）。11.9 氢氧化钠（NaOH）。11.10 庚烷磺酸钠（C7H15NaO3S）。11.11 碳酸钠（Na2CO3）。11.12 1 mol/L氢氧化钠溶液：称取40 g（精确到0.01 g）氢氧化钠（11.9），加水溶解稀释至1000 mL。11.13 磷酸盐缓冲液（ PBS）：分别称取6.45 g十二水合磷酸氢二钠（11.6），1.09 g二水合磷酸二氢钠（11.7），4.25 g氯化钠（11.8），用水溶解并定容至500 mL。11.14 1

14、 %乙酸水溶液：移取10 mL乙酸（11.4），用水稀释至1 L。11.15 2 %乙酸甲醇溶液：移取20 mL乙酸（11.4），用甲醇（11.1）稀释至1 L。11.16 乙酸铵缓冲液：称取4.6g乙酸铵（11.5）和2.02 g庚烷磺酸钠（11.10），加入约700 mL水溶解，用乙酸（11.4）调节pH值为5.0，用水稀释至1 L。11.17 4 mol/L氢氧化钠溶液：称取160 g氢氧化钠（11.9），用水溶解并稀释至1 L。11.18 4%碳酸钠溶液：称取碳酸钠（11.11）40g，用水溶解并稀释至1L。11.19 河豚毒素标准品（tetrodotoxin，分子式C11H17N3O

15、8）：纯度98%。11.20 标准溶液配制11.20.1 标准贮备液（100 mg/L）：准确称取河豚毒素10.0 mg（11.19），用少量水溶解后以甲醇（11.1）定容至100 mL，该标准贮备液置于4 冰箱中可保存一个月。 11.20.2 标准工作液：根据需要取适量标准贮备液（11.20.1），以1%乙酸水溶液（11.14）稀释成适当浓度的标准工作液。标准工作液临用现配。11.20.3 基质匹配标准工作液：以空白基质溶液配制适当浓度的标准工作液。基质匹配标准工作液要现配现用。11.21 免疫亲和柱：含河豚毒素特异性抗体的免疫亲和柱，3mL，2-8存放。使用前免疫亲和柱需回至室温（2225

16、 ），每次上样前都要将亲和柱内上次液体完全排干。11.22 0.2m微孔有机相滤膜。12 仪器和设备12.1 液相色谱仪：配有荧光检测器与柱后衍生装置。12.2 分析天平：感量0.1 mg和0.01 g。12.3 组织捣碎机。12.4 旋涡振荡器。12.5 超声波发生器。12.6 固相萃取装置。12.7 离心机：转速不低于4 500 r/min。12.8 氮吹仪。12.9 pH计。13分析步骤注：制样操作过程中必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。由于河豚毒素为剧毒物质，对于可能含有河豚毒素的产品，应避免直接接触或误食，相关的器皿和器具可以采用4%碳酸钠溶液（11.18）浸泡加热去毒处理

17、。13.1 样品的提取称取2.00 g（精确到0.01 g）（12.2）匀浆样品置于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL （精确到0.01 mL）1%乙酸水溶液（11.14），漩涡振荡2 min，60 水浴超声提取30 min，4 500 r/min离心5 min。移取5 mL（精确到0.01 mL）上清液至另一个50 mL 离心管中，加入20 mL PBS溶液（11.13）稀释，用1 mol/L的 NaOH（11.12）调至pH 78（12.9），待净化。13.2 样品的净化取出免疫亲和柱，待回至室温，去掉亲和柱堵头，放出柱内保存液后，上10 mL（精确到0.01 mL）样品液。上样结束

18、后，用10 mL 水淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用4 mL 含有2%乙酸的甲醇溶液（11.15）洗脱，收集的洗脱液于50 氮气吹干（12.8），用1 mL（精确到0.01 mL）1%乙酸水溶液（11.14）溶解并定容，经0.22m 滤膜（11.6）后供液相色谱-荧光法分析（12.1）。13.3 仪器参考条件13.3.1液相色谱条件色谱柱：Purospher Star PR-18e C18柱，4.6250 mm，粒径5 m或相当的色谱柱。流动相：乙腈-乙酸铵缓冲液（3.2.5）=（5+95，v/v）。流速：1.0 mL/min。柱温：30 。激发波长：385nm，发射波

19、长：505nm。进样量：40L。13.3.2 柱后衍生条件a）衍生溶液：4 mol/L氢氧化钠（3.2.6）。b）衍生溶液流速：0.5 mL/min。 c）衍生管温度：110 。13.4 标准曲线的制作将标准系列工作液分别注入液相色谱中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。13.5 试样溶液的测定待测样液中河豚毒素的响应值应在仪器线性响应范围内，否则应适当稀释或浓缩。标准工作液与待测样液等体积进样。根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对试样溶液的色谱峰根据保留时间进行定性（待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在2.5 %之内），外

20、标法定量。平行测定次数不少于两次。河豚毒素标准溶液液相色谱图参见附录B。14空白实验除不加试样外，均按上述测定步骤进行。15分析结果的表述用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按式（1）计算试样中河豚毒素含量：（1）式中：X试样中河豚毒素含量的数值，单位为微克每千克（g/kg）； C由标准曲线而得的样液中河豚毒素含量的数值，单位为微克每升（g/L）；C0由标准曲线而得的空白实验中河豚毒素含量的数值，单位为微克每升（g/L）；V样品最终定容体积，单位为毫升（mL）；f稀释因子，按照13.1-13.2步骤进行样品前处理时为5；m最终样液代表的试样量，单位为克（g）。注：计算结果应扣除空白值。1

21、6精密度在重复性条件下获得的两次独立测XX果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。17其他本标准方法的检出限为0.05 mg/kg，定量限为0.15 mg/kg。第三法 酶联免疫吸附法18.原理样品中的河豚毒素经提取、脱脂后与定量的特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，然后加入酶标二抗与酶标板上的抗体结合，加入底物后显色，与标准曲线比较来测定TTX含量。19.试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。19.1 抗河豚毒素单克隆抗体：杂交瘤技术生产并经纯化的抗TTX单克隆抗体。19.2 牛血清白蛋白（BSA）。19.3 人工抗原：牛

22、血清白蛋白-甲醛-河豚毒素连接物（BSA-HCHO-TTX），-20保存。19.4 河豚毒素C11H17O8N2 ：纯度大于等于98%。19.5 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体：使用前稀释至工作浓度。19.6 乙酸（CH3COOH）。19.7 氢氧化钠（NaOH）。19.8 乙酸钠（CH3COONa）。19.9 乙醚（C4H10O）。19.10 N，N-二甲基甲酰胺（C3H7NO）。19.11 3，3，5，5-四甲基联苯胺（TMB），（C16H20N2）。19.12 碳酸钠（Na2CO3）。19.13 碳酸氢钠（NaHCO3）。19.14 磷酸二氢钾（KH2PO4）。19.15 磷酸氢二钠（Na

23、2HPO4.12H2O）。19.16 氯化钠（NaCl）。19.17 氯化钾（KCl）。19.18 过氧化氢（H2O2）。19.19 吐温-20（Tween-20）。19.20 柠檬酸（C6H8O7.H2O）。19.21 98%浓硫酸（H2SO4）。19.22 0.2mol/L （pH4.0）乙酸盐缓冲液的制备。19.22.10.2mol/L乙酸钠：16.4g乙酸钠（19.8）加纯水溶解并定容至1000mL。19.22.20.2mol/L乙酸：11.4g乙酸（19.6）加纯水溶解并定容至1000 mL。19.22.3 0.2mol/L乙酸盐缓冲液（pH4.0）：取0.2mol/L乙酸钠（19.

24、22.1）2.0mL和0.2mol/L乙酸8.0mL（19.22.2）混合。19.23 0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.4）：分别称取KH2PO4 （19.14）0.2g、Na2HPO4.12H2O （19.15）2.9g、NaCl （19.16）8.0g、KCl（19.17） 0.2g，加纯水溶解并定容至1000mL。19.24 TTX标准溶液配制：19.24.1 TTX标准储备溶液配制（1.0 g/L）将河豚毒素标准品（19.4）溶于0.2mol/L乙酸盐缓冲液中（19.22），配成浓度为1.0g/L的标准储备液，密封后4保存备用。19.24.2TTX标准工作溶液的制备:

25、将TTX标准储备液（19.24.1）用0.01mol/L PBS（19.23）配制成浓度分别为5000.0g/L、2500.0g/L、1000.0g/L、500.0g/L、250.0g/L、100.0g/L、50.0g/L、25.0g/L、10.0g/L、5.0g/L、1.0g/L、0.5g/L的TTX标准工作溶液，工作溶液现用现配。19.25包被缓冲液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液）的制备（pH9.6）:分别称取Na2CO3 1.59g（19.12）、NaHCO3 2.93g（19.13），加纯水溶解并定容至1000mL。19.26 封闭液的制备:2.0g BSA（19.2）加0.01mo

26、l/L PBS（19.23）溶解并定容至1000mL。 19.27 洗液的制备:999.5mL 0.01mol/L PBS（19.23）溶液中加入0.5mL的吐温-20（19.19）。19.28 抗体稀释液的制备:1.0g BSA （19.2）加0.01mol/L PBS（19.23）溶解并定容至1000mL。19.29底物缓冲液的制备:19.29.10.1mol/L 柠檬酸溶液：21.01g柠檬酸（19.20）加纯水溶解并定容至1000mL。19.29.20.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：71.6g 磷酸氢二钠（19.15）加纯水溶解并定容至1000mL。19.29.3底物缓冲液：将0.1m

27、ol/L柠檬酸溶液（19.29.1）、0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液（19.29.2）和纯水按照24.3:25.7:50的比例现用现配。19.30 底物溶液的制备:19.30.1 TMB储存液：200mg TMB（19.11）溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺（19.10）中而成，4避光保存。19.30.2 底物溶液：将75L TMB储存液（19.30.1）、10mL底物缓冲液（19.29.3）和10L H2O2（19.18）混合而成。19.31终止液:2mol/L的硫酸溶液：取891.5mL98%的浓硫酸（19.21），缓缓加至盛有108.5mL纯水的容量瓶中混匀。19.32 0.1%乙酸

28、溶液:1mL乙酸（19.6）加到999mL纯水中。19.33 1mol/L NaOH溶液:40g 氢氧化钠（19.7）加纯水溶解并定容至1000mL。20.仪器20.1 组织匀浆器。20.2 温控磁力搅拌器。20.3 高速离心机。20.4 全波长光栅酶标仪或配有450nm滤光片的酶标仪。20.5 可拆卸96孔酶标微孔板。20.6 恒温培养箱。20.7 微量加样器及配套吸头（100L、200L和1000L）。20.8 分析天平。20.9 架盘药物天平。20.10 125mL分液漏斗。20.11 100mL量筒。20.12 100mL烧杯。20.13 剪刀。20.14 漏斗。20.15 10mL吸

29、管。20.16 100mL磨口具塞锥形瓶。20.17 容量瓶（50mL、100mL）。20.18 pH试纸。20.19 研钵。21 分析步骤21.1样品采集及运输现场采集样品后立即4冷藏，并于当天运至实验室进行检验。如果路途遥远，可于当天进行冷冻，并应保存在冷冻状态中运输至检验实验室。21.2 取样对冷藏样品或冷冻后解冻的样品，用蒸馏水清洗鱼体表面的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后用剪刀（20.13）将鱼体分解成肌肉、肝脏、肠道、皮肤、卵巢（雄性为精囊）等部分，各部分组织分别用蒸馏水洗去血污，滤纸吸干表面的水分后称重（20.8）。21.3 样品提取21.3.1将待测河豚组织用剪刀（20.13）剪

30、碎，加入5倍体积0.1%的乙酸溶液（19.32）（即1g组织中加入0.1%乙酸5mL），用组织匀浆器（20.1）磨成糊状。21.3.2取相当于5g河豚组织的匀浆糊（25 mL）于烧杯（20.12）中，置温控磁力搅拌器（20.2）上边加热边搅拌，达到100时持续10min后取下，冷却至室温后，8 000r/min离心15min（20.3），快速过滤于125mL分液漏斗（20.10）中。21.3.3滤纸残渣用20mL0.1%乙酸（19.32）分次洗净，洗液合并于原烧杯中，置温控磁力搅拌器（20.2）上边加热边搅拌，达到100时持续3min后取下，8 000r/min离心（20.3）15min过滤，

31、滤液合并于21.3.2分液漏斗中。21.3.4 在21.3.2分液漏斗的清液中加入等体积乙醚（19.9）振摇脱脂，静置分层后，放出水层至另一分液漏斗（20.10）中并以等体积乙醚（19.9）再重复脱脂一次，将水层放入100mL锥形瓶中，减压浓缩去除其中残存的乙醚后，将提取液移入50mL容量瓶（20.17）中。21.3.5 将21.3.4的提取液用1mol/L NaOH溶液（19.33）调pH至6.57.0（20.18），并用PBS（19.23）定容至50mL，立即用于检测（每毫升提取液相当于0.1g河豚组织样品）。21.3.6 当天不能检测的提取液经减压浓缩去除其中残存的乙醚后不用NaOH调p

32、H值（19.33），密封后-20冷冻保存，在检测前调节pH并定容至50mL，立即检测。21.4测定21.4.1包被酶标微孔板用BSA-HCHO-TTX人工抗原（19.3）包被酶标板，120L/孔，4静置12小时。21.4.2抗体抗原反应将纯化TTX单克隆抗体（19.1）稀释至工作浓度后分别：a）与等体积不同浓度的河豚毒素标准溶液（19.24.2）在2mL试管内混合后，4静置12小时或37温育2小时备用。此液用于制作TTX标准抑制曲线。b）与等体积样品提取液（21.3.5）在2mL试管内混合后，4静置12小时或37温育2小时备用。此液用于测定样品中TTX含量。21.4.3封闭已包被的酶标板（21

33、.4.1）用PBS-T（19.27）洗3次（每次浸泡3min）后，加封闭液（19.26）封闭，200L/孔，置37温育（20.6）2小时。21.4.4测定封闭后的酶标板用PBS-T（19.27）洗33min后，加抗原抗体反应液（21.4.2）（在酶标板的适当孔位加抗体稀释液作为阴性对照），100L/孔，37温育（20.6）2小时，酶标板用PBS-T（19.27）洗33min后，加入已稀释至工作浓度的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（19.5），100L/孔，37温育（20.6）1小时，酶标板用PBS-T（19.27）洗53min后，加新配置的底物溶液（19.30.2），100L/孔，37温育（2

34、0.6）12min后，每孔加入50L 2mol/L的H2SO4（19.31）终止显色反应，在波长450nm处测定吸光度值（20.4）。22 空白实验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。23 分析结果的表述样品中TTX的含量按式（1）计算： CVDX= （1） MX: 样品中TTX的含量，单位为微克每千克（g/kg）；C：酶标板上测得的TTX的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL），根据标准曲线按照数值插入法求得；V：样品提取液的体积，单位为毫升（mL）； D：样品提取液的稀释倍数；M：样品质量，单位为克（g）。24 精密度在重复性条件下获得的两次独立测XX果的绝对差值不得超过算术平均值的20

35、%。25 其他方法检出限为3 g/kg，定量限为10 g/kg。第四法 小鼠生物法26.原理根据河豚毒素易溶于酸性溶液原理，试样制备后经两次0.5%乙酸溶液煮沸提取，20 000 g离心收集上清液，将两次上清液合并并定容至25 mL，用于小鼠生物试验，根据小鼠注射提取液后的死亡时间，查出鼠单位，并按小鼠体重校正鼠单位，计算确定河豚毒素含量。27.试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。27.1 乙酸（CH3COOH）。27.2 氢氧化钠（NaOH）。27.3 0.5 %乙酸溶液：将5 mL乙酸（27.1）用水稀释至于1 L。27.4 1mol/L氢

36、氧化钠溶液：40g 氢氧化钠（27.2）加纯水溶解并定容至1000mL。27.5 小白鼠：28日龄，体重19 g21 g 的无特定病原体级（SPF）XX系雄性健康小鼠。28.仪器和设备28.1 均质器。28.2 电子天平：感量0.1 g 。28.3 离心机：离心力20 000 g。28.4 秒表。28.5 电炉。28.6 剪刀。28.7 镊子。28.8 手术刀。28.9 容量瓶（25mL）。29.分析步骤29.1 试样制备 29.1.1 冷冻样品装于密封塑料袋内于流水下急速解冻，蒸馏水洗净后用滤纸吸干，分解成肌肉组织、肝脏、皮肤等部分（28.8），分别称量后将各组织剪碎（28.6），充分均质（

37、28.1）。29.1.2 对于肌肉组织，准确称取样品10.0 g（28.2）于50 mL离心管中，加入0.5%乙酸溶液（27.2）11 mL，充分混匀，沸水浴中煮沸10 min（28.5），不断搅拌以防止组织结块。29.1.3 冷却至室温，20 000 g高速离心（28.3）20 min，移取上清液于50 mL离心管中。29.1.4 向沉淀中加入0.5 % 乙酸溶液（27.2）11 mL，充分混匀，沸水浴中煮沸5 min（28.5），不断搅拌以防止组织结块。29.1.5 冷却至室温，20 000 g高速离心（28.3）20 min，取上清液，将两次离心上清液合并混匀，用0.5%乙酸（27.2）

38、定容至25 mL（28.9）。此提取液1 mL相当于原脏器或者组织的0.4 g。29.1.6 肝脏和皮肤的处理方法为：用0.5 % 乙酸（27.2）处理后，不需煮沸直接20 000 g高速离心（28.3）20 min，取上清，将两次离心上清液合并混匀，用0.5 % 乙酸（27.2）定容至25 mL（28.9）。另外，因肝脏中含有大量水分，在加入乙酸提取时，应尽量减少乙酸溶液体积（8 mL为宜），以防止TTX提取液稀释倍数过大。注1：制备样品时，如果样品完全解冻，取样时，组织中的毒素有可能会转移到其他组织中。因此，对于冷冻原料，要在半解冻的情况下进行取样操作。制备样品若不能及时检验，应置于4 冰

39、箱保存，在24 h内检验。注2：作为样品的脏器或者组织不足10 g 的情况下，按照以上方法进行提取操作，适量减少抽出液。注3：提取液里不含有离心分离液表面上被分离出来的油状物、类似明胶样的物质或者脂质类。29.2 试样溶液的测定29.2.1 选取19.0 g21.0 g 的无特定病原体级（SPF）XX系雄性健康小鼠6只（27.3），称取并记录质量。随机分为实验组和空白对照组两组，每组3只。29.2.2 对每只试验小鼠腹腔注射1 mL提取液（29.1.5或29.1.6）或空白对照液（27.2）。注射过程中若有一滴以上提取液溢出，须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠。29.2.3 记录注射完毕时间

40、（28.4），仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间（到小鼠呼出最后一口气止）（28.4）。29.2.4 若注射样品原液后，小鼠死亡时间小于7 min，则按附录C计算出样品原液1 mL中所含的毒量，以这个值为基准，配制出使小鼠在7 min13 min死亡所需的稀释液浓度，再注射至少3只小鼠以确定样品的毒力。稀释时使用0.5 % 乙酸（27.2）。29.2.5 若注射样品原液后，小鼠的死亡时间大于13 min，则直接根据中间致死时间确定样品的毒力。29.2.6 小鼠中毒死亡症状：被注射了河豚毒素的小鼠初期安静，呼吸困难，急促，腹部收缩加快，反应迟钝，继而出现突然疾走，急跑急跳，四处乱窜，东倒西歪

41、，翻转乱跳等挣扎动作，数十秒后，小鼠后腿剧烈抽搐，23次后爬卧不动，腹部呼吸逐渐微弱减慢，最后死亡。以停止呼吸作为判断死亡的标准。30.分析结果的表述30.1 毒力的计算根据试验中所得的小鼠致死时间，算出中间致死时间，然后按附录C计算出毒量（若中间致死时间刚好处于表A.1中给出的两时间中间时，则取两时间中较大的时间值；若介于表A.1中给出的两时间中但不正好处于中间时，则取更接近于中间致死时间的值）。若小鼠体重不正好为20.0 g，则按附录D进行小鼠单位（MU）的误差补正，通过补正后的小鼠单位（MU）中间值表示出稀释液的毒量。1MU的定义为使体重20.0 g的无特定病原体级（SPF）XX系雄性小

42、鼠30 min死亡的毒量。相当于0.18g TTX。用得出的MU值乘以稀释倍数计算出1g原样品相对应的MU。每克样品中河豚毒素的含量按式（1）计算：X=MEDW （1）式中：X每克样品中TTX的含量，单位为MU；M 每毫升注射液的鼠单位数，MU/mL；E 提取系数，本方法提取系数为3.11；D 稀释倍数；W 重量校正系数。示例：从10.0 g脏器提取25 mL样品原液对3只小鼠进行试验，若中间致死时间是5 min 15 s，小鼠体重为19.5 g，样品原液的毒力约为3.58 MU/mL。按附录C可以推测，稀释2倍后死亡时间约为10 min。配制2倍稀释液进行试验，若得出中间致死时间为10 min，则稀释液的毒力即为1.80 MU/mL。因为稀释倍数是2，提取系数为3.11，重量校正系数为0.98，所以毒力计算如下：原样品1 g 的毒力 = 1.803.1120.98 = 1