实验四 RNA的提取及其纯度检测

1、实验四RNA的提取及其纯度检测实验目的：了解Trizol提取总RNA的原理，掌握高质量完整总RNA提取的技术以及电泳变性胶电泳检测和浓度及纯度鉴定方法。实验原理Trizol是一种酚与异硫氰胍的混合物，非常容易把组织和细胞中的总RNA提取出来。在加入氯仿离心后，RNA保留在水相中，与DNA和蛋白质分离开来（保留在有机相中）。吸取水相，加入异丙醇成淀RNA,从而得到完整纯度高的总RNA。实验内容材料小鼠新鲜肝试剂总RNA提取纯化试剂：Trizol（Invitrogen）;DEPC（Amersham），无水乙醇，已丙醇；电泳试剂：TAE，上样缓冲液（50%甘油，10mMEDTA，0.25%溴酚蓝，0

2、.25%二甲苯青）,琼脂糖。操作步骤总RNA的提取1小鼠肝组织的匀浆裂解断颈处死小鼠，立即解剖取出肝脏，取50-100mg到玻璃匀浆器中，假如ImlTrizol反复匀浆膜碎组织，使细胞完全裂解。按1mlTrizol加入0.2ml氯仿，震荡15秒，室温放置3分钟，12000 xg，4C离心15分钟。RNA的沉淀将离心的上清转移到新的离心管中，按1mlTrizol加入0.5ml异丙醇，震荡15秒，室温放置10分钟，12000 xg，4C离心10分钟。RNA的洗涤与溶解吸掉上清，加入1ml75%乙醇洗涤沉淀，4C,7500 xg离心5分钟。吸掉上清，空气干燥RNA沉淀10分钟，加入适量的DEPC处理

3、水（50口）溶解RNA,立即电泳和紫外浓度和纯度鉴定，剩余-70C保存备用。结果在凝胶上可以看到一般可以看到三条带，其中从上样孔开始对应的带的分别是28S,18S和5S,其中18S和28S的条带明显清晰，而5S的带比较弱，28S的带的亮度是18S带亮度的2背左右，说明RNA保持完整。紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度总RNA用10mM的Tris-HCl(pH8.O)稀释，利用紫外分光光度计测定A260和A280值，根260280据1OD=40ug定量,并计算A260/A2g0比值，每一样品重复3次。如果A260/A2g0比值均在2.0以上(2.0-2.2之间)，说明RNA的纯度很好。2602

4、g0注意事项创造无Rnase的环境注意以下几点，以防止Rnase污染样品，保证分离到全长mRNA：1、手和空气中的细菌霉菌是主要的Rnase污染源。为防止污染，应在超净台上无菌操作。这些试剂都要反复使用，所以开启和关闭试剂瓶一定防止污染。一直带塑料手套。2、最好用一次性使用塑料制品提RNA,这些制品常是无RNase的，无须灭活RNase。3、不是一次性使用的玻璃和塑料制品，用前应除RNase。玻璃制品应于200Q烘烤过夜，塑料制品用前用0.1NNaOH，1mMEDTA作彻底冲洗，再用无RNase水冲洗。4、用户自备的溶液应用0.05%DEPC处理过夜，再高压灭菌30分钟以出去痕量DEPC。实验

5、五逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段实验目的了解RT-PCR的原理，掌握RT-PCR扩增基因的特异片段的技术。实验原理PCR（PolymeraseChainReaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。编码蛋白质的基因在转录后形成mRNA，mRNA翻译后编码产生蛋白质。真核生物的mRNA的3端有多个腺苷酸，形成寡聚腺苷酸的尾巴

6、，因此可以与OligodT结合，在反转录的作用下形成cDNA。再通过基因的特异引物PCR扩增得到基因的特异片段，此方法称为2步法。也可以根据已知基因的序列设计引物，以基因的特异引物进行逆转录，得到特异基因的cDNA，以此为摸板PCR扩增得到特异基因片段，由于此法转录和PCR扩增在同一反应管中进行，转录和扩增的引物相同，因此称为一步法。SynthesisoffirststrantfcDNAwilhreversietranscriptase(AMV)3rCDNA1I51Second帛惱nd亡DMAsynthesizedwiilhAMVOptimised励$3AmplrfytDNA&3r5OneSt

7、epRT-PCR的原理一步法的优点：RNAS适用于所有RNA扩增片段大小5!bp以下反转录酶人汕耶由来的辰转录酶（庚转录反应温度在貶55U）DNAPolymeraseAMV-OptfmizedTaq操作在同一反应管中连续进（SffiRT反应和PCRjg应）实验内容材料小鼠新鲜肝试剂总RNA提取纯化试剂：Trizol(Invitrogen);DEPC(Amersham)无水乙醇，已丙醇；RT-PCR试剂盒逆ReverTraAce-a-购自日本东洋纺公司本试剂盒采用了两步反应法(TwoStep法)完成RT-PCR反应。RNA-cDNA-PCR反应操作在不同反应体系中进行，先由反转录酶从RNA反转录

8、为cDNA，再由cDNA扩增目的片段。操作步骤总RNA的提取根据上次实验总RNA的提取进行。按下列组成配制RT-PCR反应液。在0.2ml离心管中加入TOC o 1-5 h zRNaseFreeH2O5.5卩1OligodT5卩1RNA1.5卩1Total12gl70C水浴5min,迅速在冰上冷却2min。简短离心后收集反应液，加入以下组分：5xRTBuffer4卩1dNTP2卩1RNaseinhibitor1卩1ReverTraAce1g1此时，配置成2om体系。逆转录反应为42C60min,95C5min。PCR反应在PCR仪上设置好程序：94C4min,变性94C15sec，56C25s

9、ec，72C30sec40个循环72C10min，4C保存根据GenBank中小鼠actin的基因序列，设计正向引物和反向引物分别为：5ACCTCTATGCCAACACAGTG3,5GGACTCATCGTACTCCTGCT3,引物合成后用无菌水稀释成20yM。在0.2ml离心管中按下列顺序加样，建立50卩1体系。ddHO215卩110 xBuffer2.5卩1MgSO41.5卩1dNTP2卩1Primer10.5卩1Primer20.5plcDNA2glHSTaq1glTotal25gl混匀，短暂离心。将离心管放在PCR仪上进行PCR反应。5电泳检测首先按照下列步骤制胶：称取l.Og琼脂糖，加入100mllxTAE电泳缓冲液。加热或沸水浴后使琼脂糖溶解。待凝胶冷至601左右，加入核酸染料，核酸染料的终浓度为0.05yl/ml。将琼脂糖溶液倒入模具，凝胶厚度一般为0.3-0.5cm,室温下15-30min后，