蛋白酶活性测定方法

1、水产动物酶活性测定方法_、分析样品的采取与处理每箱随机各取3尾异育银鲫，称重，于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏，测定肠道长度， 剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入-26C冰箱中 迅速冷却保存，供测酶活性用。二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食 靡0.5g,放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20niin（13, 000g）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各 l.Ogo按样品重量加10倍的4

2、C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4nun.800ipm 匀浆玻璃管外设冰浴）。匀浆液在4C下离心20分钟（13, 000g）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr内测定完毕。酶粉及饲料：取2. 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤 留置滤液待测。测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置 滤液待测。三、酶活性测定蛋白酶测定：前、中、后肠，肝胰脏。方法：福林一酚试剂法1.1原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA）的氨基酸（如酪

3、氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等），这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应），用 分光光度计测定。1.2蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨 酸的酶量为1个酶活力单位。13试剂福林试剂（己配）0.4M碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（NsCCh） 42.4g用水溶解和定容至1, OOOnil,存放与具胶塞的试剂瓶中。0.1M三氯醋酸（TCA）：用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1, OOOnil cL酪氨酸。缓冲液：磷酸二氢钙一氢氧化钠缓冲液。 TOC o 1-5 h z A： 0.2mobL KH2PO4 (nil):50;B： 0.

4、2mobL NaOH(nil)29.63C：水(ml)120.37PH (20C )：7.0酪蛋白溶液：精确称取酪素2.000g,先用少量0.5N氢氧化钠浸润后，加入少量缓冲液，在沸水浴中加热，经常但不要剧烈的搅拌使之完全溶解，冷却 后移入1001111容量瓶中，并用相应的缓冲液定容到刻度。若定容时泡沫过 多，可加入12滴乙醇消泡。酪蛋白溶液可在4C保存一周，变质后不能使 用。1.4标准酪氨酸曲线的绘制将精确称取L酪氨酸（先在105C干燥23Hr） lOOmg小心地溶于60ml O.lmoVL HCL中制得酪氨酸溶液。酪氨酸必须完全干燥并且是色谱级 另L 一定要酪氨酸完全溶解，并且用去离子水稀

5、释至1L ,该溶液含酪 氨酸100微克/毫升。根据下面的规定，从上述储备溶液制备含酪氨酸10、20、30、40、50、 70、80微克/亳升。移取上述溶液21111,加入一系列试管中，加5ml 0.4M Na2CO3然后加稀释 的福林试剂1ml至各试管，立即混合均匀，并在30C恒温水浴中显色 20nun,以721型（或72型）分光光度计在波长680nm处测定光密度（O。 D值）。计算K值；以OD值为纵坐标，酪氨酸溶度为横坐标，绘制标准曲线， 微克数，确定K值。1.5操作步骤将酪蛋白溶液放入30C恒温水浴中预热5mm,取lull酶液注入试管中, 按以下程序操作。酶液lull在30C恒温水浴中预热

6、12111U1+2%酪蛋白1ml加入时立即记时，精确反应lOmin+ 0.4MTCA 2nil立即摇匀，终止反应。将各管剧烈混合并在30C保持30mm,以完全沉淀反应后过量的酪蛋白。 从水浴中取出静止10mm过滤（11cm的whatinan43#滤纸） +滤液lull0.4M Na2CO3 5nil稀释福林试剂lull摇匀，30C恒温水浴显色20分钟测定OD值用720型分光光度计测定（波长6801U11）试验。空白试验：酶液1ml，先向其中加入三氯醋酸，然后加酪蛋白溶液。其余步骤同试验。1.6计算公式（公式1）活力单位=4/10 XKXODX ivm其中：4反应总体枳为4ml10反应的时间为l

7、OniuiK比色计常数n酶液稀释倍数m样品的质量（g）（公式2）活力单位=A X 4 X wlO/m其中：A酶活力测定的光密度值，在标准曲线上查得响应的酪蛋白的微克数。4反应的总体枳反应10分钟酶稀释倍数m样品的质量（g）2碘一淀粉比色法测定淀粉酶2. 1原理淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度己知并且过量的情况 下，加入碘液与未水解的淀粉生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从 而计算AMS的活力。2试剂0.4mg/inl底物缓冲液：60mlX2瓶，4C冰箱保存。O.lmol/L碘储备液：7mlX2瓶，4C避光保存。O.Olmotr碘应用液的配制：将储备液：蒸循

8、水=1： 9稀释，4C避光保存。2. 3操作测定管（U管）空白管（0）管底物缓冲液（1111）30 C预温5分钟1.01.0酶液（ml）0.02混匀，30C水浴，准确反应7.5分钟碘应用液（ml）1.01.0蒸馅水6.06.02混匀在660mn波长，1cm光径，蒸循水调零测光密度。2. 4活性单位：1克食靡或组织中AMS,在30C与底物作用1mm,水解Img淀粉为1个单位。2- 5计算公式（空白管吸光度一测定管吸光度）X0.4Xlniui X 4 XFAMS u/dl= 空白管吸光度X1.0X 7.5min X 0.02 X M注：0.4底物缓冲液浓度1.0活性单位定义水解Img淀粉量4酶液稀释了4倍0.02酶液F测定时稀释的倍数W-样品重量（g）3脂肪酶活性测定加5mL0.025 mol/LpH 7.5磷酸缓冲液和4mL聚乙烯醇橄榄油乳化液于100 mL锥形瓶中，置反应温度(375 水浴中预热510mm,然后加入匀浆粗酶液 ImL,准确反应30mm后，立即加入