荧光定量PCR常见问题及解答

1、荧光定量PCR常见问题及解答更新畤冏：2010-12-10 10:43:37一、无Ct值（信号）出现：反应循环数不够：一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加 循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；检测荧光信号的步骤有误：一般采用72C延伸时采集荧光，Taqman 方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已 延伸；模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。二、如何确认模板中是否含有PCR反应阻害物质：有

2、时RNA或cDNA模板中存在对反转录和荧光PCR反应的阻害物质。为 了确认这样的阻害物质的有无，我们可以使用高浓度的模板按3-4个梯度稀释， 并使用其进行荧光定量PCR反应。如果无阻害物质存在，得到的Ct值就会依模板浓度的变化而变化；而如果模板中有阻害物质的存在，实验过程中我们就会 发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。三、Ct值出现过晚：反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；PCR各种反应成分的降解或加样量不够；扩增产物片段过长：一般采用100 200bp的扩增长度。四、标准曲线的线性关系不佳：加样存在误差，标准品稀释不呈梯度；标准品降解：标

3、准品尽量避免反复冻融；引物或探针不佳：重新设计；模板中存在抑制物，或模板浓度过高。五、阴性对照液出现明显的扩增：荧光PCR mix或水被污染；引物二聚体的出现：在35循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可 配合溶解曲线进行分析;反应过程中探针降解：用PAGE电泳对探针进行检测。六、溶解曲线不止一个主峰：引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；引物浓度不佳：适当调整引物浓度；退火温度低：提高退火温度；镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；模板中有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的污染，或 通过引物设计避免非特异扩增。七、如何避免荧光定量PCR中基因组DNA扩增：引物设计时避免基因组D

4、NA扩增；在RNA提取过程中使用DNase I处理去除RNA中混有的基因组DNA。八、扩增效率低：反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法；反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。九、重复性不好：加样不准确；仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好；模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍 数。十、扩增曲线不正常，刚进入指数期就很快进入平台期并向右下弯曲：基线等设置不当：按仪器说明书重新操作；模板量过多：当扩增曲线在10个循环内起峰时，应将模板稀释100 一 1000倍后使用。十一、各孔间的荧光信号如何进行校正：由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发效率的差异等 偶然误差不可避免，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，以消除这 些因素对定量结果的影响。这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料来实现，一般采用红色ROX荧光，称为阳性参比信号。ROX在反应缓冲液中的浓 度是固定的，因此其信号的强度与反应体系的总体积和总的荧光激发效率正相关。ROX校正可以提高定量数据的精度和重现性，减少孔间差异。十二、荧光定量PCRCT值一般在多少后认为模板没扩增：当进入对数期的循环数大于3