实验一植物原生质体的分离和培养一．教学目标：了解植物原生质

1、实验一 植物原生质体的分离和培养一教学目标：了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。二重点：掌握分分离和培培养原生生质体的的技术、方方法和原原理。掌掌握细胞胞活性的的检测方方法。掌掌握细胞胞计数的的原理和和方法。三难点：分离和和培养原原生质体体的技术术。四授课方方式与教教学方法法：讲解解原理、实实验操作作示范或或具体指指导。五教学内内容:实验原理植物原生质质体(pprottopllastt)是除除去细胞胞壁后 为原生生质所包包围的“裸裸露细胞胞”,是是开展基基础研 究的理

2、理想材料料。其中中,酶解解法分离离原生质质体是一一个常用用的技术术,其原原理是植植物细胞胞壁主要要由纤维维 素、半半纤维素素和果胶胶质组成成,因而而使用纤纤维素 酶、半半纤维素素酶和果果胶酶能能降解细细胞壁成成分,除除 去细细胞壁,即可得得到原生生质体。由由于原生生质体内内 部与与外界环环境之间间仅隔一一层薄薄薄的细胞胞膜,必必须保持持在渗透透压平衡衡的溶液液中才能能保持其其完整性性, 使原原生质体体分离后后不致膨膨胀破裂裂，渗透透剂常用用甘露醇醇或蔗糖糖，酶液液还应含含一定CCa2+来稳定定原生质质膜。 其次,还应当当考虑取取材、酶酶的种类类和纯度度、酶液液 的渗渗透压、酶酶解时间间及温度度

3、等因素素对分离离原生质质 体的的影响。将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。测定原生质质体的活活性有多多种方法法。荧光光素双醋醋酸酯(FDAA)染色色是常用用的一种种方法,FADD 本身身无荧光光,无极极性,可可透过完完整的原原生质膜膜。 一一旦进入入原生质质体后,由于受受到酯酶酶分解而而产生 具有荧荧光的极极性物质质荧光素素。它不不能自由由出入原原 生质质膜,因因此有活活力的细细胞能产产生荧光光,无活活力 的的原生质质体不能能分解FFAD无无荧光产产生。 细胞计数一一般用血血细胞计计数极，按按白细胞胞计数法法进行计计数。从理论上讲讲，植物物体的任任何一部部分都可可

4、以通过过酶解作作用去除除细胞壁壁而得到到原生质质体。但但在实际际操作中中，只有有幼嫩的的组织才才能完成成去壁的的过程。所所以，为为了制备备健康的的原生质质体，一一般选用用根尖、茎茎尖、嫩嫩叶及对对数生长长期的愈愈伤组织织为材料料，一旦旦细胞具具有木质质化或次次生加厚厚的外壁壁，则不不能被酶酶降解。因因此，取取材成为为实验成成功与否否的首要要问题。 花期短短的花瓣瓣，由于于其组织织鲜嫩，又又具有色色素标记记，是该该实验中中较好的的材料。实验方法1把叶片片(或花期期短的花花瓣)洗净，把把表面水水吸干。（22人一组组）2撕去叶叶片背面面的表皮皮，用22ml离心管管的盖打打下1圆圆片。圆圆片扣压压于

5、00.5mml酶液液面上。让去除下表皮的一面接触酶液，辅满一层。0.5ml酶液已放入2ml离心管中。（酶液：4%纤维素酶， 2%果胶覆酶，PH5.8，0.6mol/L甘露醇）。32830保温酶酶解26h（放培培养箱中中）；镜镜检叶肉肉细胞原原生质体体。用血血球计数数板计数数。46000 rppm 离离心5mmin，使使原生质质体沉降降。吸除除上面的的酶液。5加0.2 mmol/L 的的加氯化化钙液00.5mml，轻轻轻吹打打均匀。6用1mmL注射射器向离离心管底底部缓缓缓注入220%的的蔗糖溶溶液1mml，出出现下部部蔗糖液液，上部部原生质质体悬浮浮液.以6000rpmm离心110 mmin，

6、在在两液相相之间出出现一条条绿色带带，便是是纯净的的原生质质体。7用1mmL注射射器取出出管底的的杂质、下下部蔗糖糖溶液和和上部氯氯化钙液液。少许许原生质质体于载载片上，盖盖片观察察其形态态，检测测纯度。8加MSS培养液液液1mml洗涤涤，轻轻轻混匀，6600 rpmm 离心心5miin，使使原生质质体沉降降。吸除除上面的的溶液。9加MSS培养液液液0.5mll, 轻轻轻混匀匀, 用血血球计数数板计数数细胞密密度, FDAA染色测测定原生生质体的的活性。10扣上上盖子，在在26下进行行暗培养养。观察察细胞壁壁的再生生和细胞胞分裂。实验结果结果讨论六课堂小小结：根据学生的的实验结结果进行行总结。

7、 细胞计数板板的使用用：细胞计数板板系一长长方形厚厚玻片，常常用的改改良牛氏氏(Immproovedd-Neeubaauerr) 计数板板在中央央横沟的的两边各各有一计计数室，两两计数室室结构完完全相同同。计数数室较两两边的盖盖玻片支支柱低00.1毫毫米。因因此，放放上盖玻玻片时，计计数板与与其间距距即计数数室空间间的高为为0.11毫米(图8-1)。在在低倍显显微镜下下可见计计数室被被双线划划分成个边长长为毫毫米的大大方格。四四角的大大方格又又各分为为个个中方格格，这是是用来计计数白细细胞的。中中央大方方格被划划分为个中中方格，每每一中方方格又划划分成个小小方格(图82称=4000小方格格，也

8、有有的计数数板为=4000格的，小小方格面面积一致致)。中中央大方方格的四四角及中中心个个中方格格(者者则为四四角上的的中方格格)为红红细胞或或血小板板计数范范围。细胞计数先用试管稀稀释法制制备禽类类血细胞胞悬液：将禽类类红细胞胞稀释液液、分别置置水浴锅锅中预热热到，取液mmL于试试管中，用用吸血管管加入新新鲜鸡血血(或肝肝素抗凝凝血)霯，再再加入液mmL混匀匀，置该该水浴锅锅中保温温ss左右，置置室温，即即为待检检的血细细胞悬液液。可用用于充液液计数。取取干洁的的计数板板，置于于水平的的显微镜镜载物台台上，盖盖上盖玻玻片，使使两侧各各空出少少许。摇摇匀血细细胞悬液液，用滴滴管吸取取，将滴滴管

9、尖轻轻轻置于于盖玻片片边缘外外，让滴滴出的血血细胞悬悬液凭毛毛细管作作用吸入入计数室室内，刚刚好充满满计数室室为宜(图83)。静静置mmin后后计数，先先用低倍倍镜观察察，不均均匀则抛抛弃。计计数时用用虹彩、集集光器、反反光镜等等调节入入射光角角度和强强度，认认清 计数室室位置。采采用“由上至至下，由由左至右右，顺序序如弓”的顺序序，对压压边线细细胞采取取“数上不不数下，数数左不数数右”的原则则(图884)。依次次计数并并记录个中方方格中分分别有多多少个红红细胞。注意事项1计数板板、盖玻玻片和测测定管用用清水冲冲洗，再再用绸布布或细布布沾干。2.充液液前应充充分混匀匀血细胞胞悬液，充充液要连连

10、续、适适量，充充液后应应待血细细胞下沉沉后再计计数。3.计数板板、盖玻玻片、吸吸血管及及测定管管等用过过后必须须立即按按要求洗洗涤干净净。实验二、细细胞膜的的通透性观察实 验 目目 的 了解细胞膜膜的渗透透性及各各类物质质进入细细胞的速速度。 实 验 原原 理 将红细胞放放入数种种等渗溶溶液中，由由于红细细胞对各各种溶质质的透性性不同，有有的溶质质可以渗渗入，有有的不能能渗入，渗渗入的溶溶质能够够提高红红细胞的的渗透压压，所以以促使水水分进入入细胞，引引起溶血血，由于于溶质透透入速度度互不相相同，因因此溶血血时间也也不相同同。 实 验 用用 品 一、器材 50ml烧烧杯, 试管（11100cm

11、）, 100ml移移液管, 试管管架。 二、材料 羊血。 三、试剂 0.117mool/LL氯化钠钠，0.17mmol/L氯化化胺，00.177moll/L醋醋酸胺，00.177moll/L硝硝酸钠，00.122moll/草酸酸胺，00.122moll/硫酸酸钠，00.322moll/葡萄萄糖，00.322moll/甘油油，0.32mmol/乙醇，00.322moll/丙酮酮。 实 验 方方 法 一、羊血细细胞悬液液取50mll小烧杯杯一个，加加1份羊羊血和110份00.177moll/L氯氯化钠，形形成一种种不透明的红色液液体，此此即稀释释的羊血血。二、低渗溶溶液取试管一支支，加入入10mm

12、l蒸馏馏水，再再加入11ml稀稀释羊血血，注意意观察溶溶液颜色色的变化化，有不不透明的的红色逐逐渐澄清清，说明明红细胞胞发生破破裂造成成1000%红细细胞溶血血，使光光线比较较容易透透过溶液液。三、羊红细细胞的渗渗透性1、取试管管一支，加加入0.17mmol/L氯化化钠100ml，再再加入11ml稀稀释羊血血，轻轻轻摇动，注注意观察察溶液颜颜色有无无变化？有无溶溶血现象象？为什什么？2、取试管管一支，加加入0.17mmol/L氯化化胺100ml，再再加入11ml稀稀释羊血血，轻轻轻摇动，注注意观察察溶液颜颜色有无无变化？有无溶溶血现象象？为什什么？3、分别在在另外88种等渗渗溶液中中进行同同样

13、实验验。步骤骤同2。实 验 结结 果并对实验结结果进行行比较和和分析。实验三 细胞骨骨架的观观察一、实验目目的掌握用光学学显微镜镜观察植植物细胞胞骨架的的原理 及方法法，观察察光学显显微镜下下细胞骨骨架的网网状 结结构。 二、实验原原理植物细胞用用适当浓浓度的TTrittonXX1000处理 后，可可破坏细细胞内蛋蛋白质，但但细胞骨骨架系统统的蛋 白质却却保护完完好。考考马斯亮亮蓝R2250(Cooomasssiee brrillliannt bbluee R2250)是一种种蛋白质质染料，处处理后 的材料料用考马马斯亮蓝蓝R2550(考考马斯亮亮蓝R2250) 染色色后，用用光学显显微镜观观

14、察，可可以见到到一种网网状 结结构，即即是细胞胞骨架结结构。三、材料洋葱鳞叶四、试剂1)2考考马斯亮亮蓝R2250染染色液：称考马马 斯亮亮蓝R225011g，溶溶于2550mll无水乙乙醇中，加加 冰醋醋酸355ml.再加蒸蒸馏至5500mml. (2)磷酸酸缓冲液液(pHH 68)：600mmoolLL 磷酸酸缓冲液液，调至至pH66.8 (3)M缓缓冲液(pH 722)500mmoolLL咪唑， 50mmmoll/L)氯化钾钾、05mmmolL氯化化镁、1mmmol/L 乙乙二醇(a-氨氨基乙基基)醚四四乙酸、00.1mmmoll/L乙乙二胺四四乙酸； 1mmmollL巯巯基乙醇醇，调至

15、至pH 722。 (4)1%Triion X-1100：用M缓缓冲液配配制。 (5)3%戊二醛醛：用磷磷酸缓冲冲液配制制； (6)中性性树胶。 仪器(请参参看 HYPERLINK /life/class/cellbiologylab/list.asp?Ycbcls=仪器图库 仪器器图库)：显微微镜，烧烧杯，镊镊子。玻玻璃滴管管，载玻玻片 五、实验步步骤1.用镊子子撕取洋洋葱鳞叶叶内侧的的表皮若若干片 约1ccm2大小若若干片)，置于于50mmL烧杯杯中，加加 入ppH6.8磷酸酸缓冲液液，使其其下沉； 2.吸去磷磷酸缓冲冲液，用用1TTritton X1000 处理理20mmin。3.吸去TT

16、ritton X1000，用MM缓冲液液洗3 次,每每次5mmin。 4.用3戊二醛醛固定330miin。 5.磷酸缓缓冲液(pH 688)洗33次，每每次5mmin。6.0.22%考马马斯亮蓝蓝R2550染色色10mmin。 7.蒸馏水水洗2次次，然后后将样品品置于载载玻片上上,加盖盖玻片，于于普通光光学显微微镜下观观察。 8.如果染染色效果果好，则则可依次次用500乙 醇、770%乙乙醇,995乙乙醇、正正丁醇、二二甲苯处处理 样样品,各各5miin,然然后将样样品平展展于载玻玻片上，加加 一滴滴中性树树胶，盖盖上盖玻玻片封片片，制成成永久切切片。六、实验报报告描绘所观察察到的洋洋葱鳞叶叶

17、细胞骨骨架图。实验四、线线粒体和和液泡系系的超活活染色与与观察活体染色是是能使生生活有机机体的细细胞或组组织特异异性着色色但对活活样品又又没有毒毒害作用用的一种种活体染染色方法法，其目目的是显显示生活活细胞内内的某些些结构，而而不影响响细胞的的生命活活动和产产生任何何物理、化化学变化化以致引引起细胞胞的死亡亡。活体体染色技技术可用用来研究究生活状状态下的的细胞形形态结构构和生理理、病理理状态。 通常把活体体染色分分为体内内活体染染色与体体外活体体染色两两类。体体外活体体染色又又称超活活染色，它它是由活活的动、植植物分离离出部分分细胞或或组织小小块，以以染料溶溶液浸染染，染料料被选择择固定在在活

18、细胞胞的某种种结构上上而显色色。活体体染料之之所以能能固定、堆堆积在细细胞内某某些特殊殊的部分分，主要要是靠染染料的“电化学学”特性。碱碱性染料料的胶粒粒表面带带阳离子子，酸性性染料的的胶粒表表面带有有阴离子子，而被被染的部部分本身身也是具具有阴离离子或阳阳离子，这这样，它它们彼此此之间就就发生了了吸引作作用。但但并非任任何染料料均可用用于活体体染色，理理论上应应选择那那些对细细胞无毒毒性或毒毒性极小小的染料料，且使使用时需需要配成成稀淡的的溶液。一一般说来来，最为为适用的的是碱性性染料，这这可能是是因为它它具有溶溶解在类类脂质(如卵磷磷脂、胆胆固醇等等)的特特性，易易于被细细胞吸收收。詹纳纳

19、斯绿BB(Jaanuss grreenn B)和中性性红(nneuttrall reed)两两种碱性性染料是是活体染染色剂中中最重要要的染料料，对于于线粒体体和液泡泡系的染染色分别别具有专专一性。 实 验 目目 的1、观察动动、植物物活细胞胞内线粒粒体、液液泡系的的形态、数数量与分分布； 2、学习一一些细胞胞器的超超活染色色技术。实 验 原原 理 线线粒体是是细胞内内一种重重要细胞胞器，是是细胞进进行呼吸吸作用的的场所。细细胞的各各项活动动所需要要的能量量，主要要是通过过线粒体体呼吸作作用来提提供的。活活体染色色是应用用无毒或或毒性较较小的染染色剂真真实地显显示活细细胞内某某些结构构而又很很少

20、影响响细胞生生命活动动的一种种染色方方法。詹詹纳斯绿绿 B是是线垃体体的专一一性活体体染色剂剂。线粒粒体中细细胞色素素氧化酶酶使染料料保持氧氧化状态态(即有有色状态态)呈蓝蓝绿色，而而在周围围的细胞胞质中染染料被还还原，成成为无色色状态。中性红为弱弱碱性染染料，对对液泡系系(即高高尔基体体)的染染色有专专一性，只只将活细细胞中的的液泡系系染成红红色，细细胞核与与细胞质质完全不不着色，这这可能是是与液泡泡中某些些蛋白质质有关。 实 验 用用 品1、器材 显显微镜、恒恒温水浴浴锅、解解剖盘、剪剪刀、镊镊子、双双面刀片片、解剖剖盘载载玻片、凹凹面载玻玻片、盖盖玻片、表表面皿、吸吸管、牙牙签、吸吸水纸

21、。 2、试剂（1）Riingeer溶液液： 氯化钠 00.855g (变温动动物用00.655g) 氯化钾 00.255g 氯化钾 00.255g 氯化钙 00.033g 蒸馏水 1100mml （2）100%、11/30000中中性红溶溶液： 称称取0.5g中中性红溶溶于500ml Rinngerr液，稍稍加热 (300400)使之之很快溶溶解，用用滤纸过过滤，装装入棕色色瓶于暗暗处保存存，否则则易氧化化沉淀，失失去染色色能力。临临用前，取取已配制制的1%中性红红溶液11ml，加加入299ml Rinngerr溶液混混匀，装装入棕色色瓶备用用。（3） 11%、11/50000詹詹纳斯绿绿B溶

22、液液 称称取500mg詹詹纳斯绿绿B溶于于5mll Riingeer溶液液中，稍稍加微热热(300400)，使使之溶解解，用滤滤纸过滤滤后，即即为1%原液。取取1%原原液l ml加加入499ml Rinngerr溶液，即即成1/50000工作作液装入入瓶中备备用。最最好现用用现配，以以保持它它的充分分氧化能能力。 实验材料 人口腔上皮皮细胞，小小麦种子子或黄豆豆幼根根根尖。实 验 方方 法1、人口腔腔粘膜上上皮细胞胞线粒体体的超活活染色与与观察清洁载玻片片放在337恒温水水浴锅的的金属板板上 滴2滴1/50000詹纳纳斯绿BB染液 用牙签口腔腔颊粘膜膜处稍用用力刮取取上皮细细胞 刮下的粘液液状

23、物放放大载玻玻片的染染液滴中中 染色10l5mmin(注意不不可使染染液干燥燥，必要要时可再再加滴染染液) 盖上盖玻片片,显微微镜下观观察 2、植物细细胞液泡泡系的超超活染色色与观察察 取豆芽的根根尖 用刀片纵纵切根尖尖 放入中性红红染液滴滴中，染染色510mmin。 吸去染液，滴滴一滴RRingger液液 盖上盖玻片片进行镜镜检(镊镊子轻轻轻地下压压盖玻片片，使根根尖压扁扁，利于于观察) 实 验 结结 果 在高倍倍镜下，先先观察根根尖部分分的生长长点的细细胞，可可见细胞胞质中散散在很多多大小不不等的染染成玫瑰瑰红色的的圆形小小泡，这这是初生生的幼小小液泡。然然后，由由生长点点向延长长区观察察

24、，在一一些已分分化长大大的细胞胞内，液液泡的染染色较浅浅，体积积增大，数数目变少少。在成成熟区细细胞中，一一般只有有一个淡淡红色的的巨大液液泡，占占据细胞胞的绝大大部分，将将细胞核核挤到细细胞一侧侧贴近细细胞壁处处。实验报告（1）. 绘口腔腔上皮细细胞示线线粒体的的形态与与分布 （2）. 绘蟾蜍蜍胸骨剑剑突软骨骨细胞示示液泡系系的形态态与分布布实验五 叶叶绿体的的分离与与荧光观观察叶绿体是植植物细胞胞所特有有的能量量转换细细胞器，光光合作用用就是在在叶绿体体中进行行的, 由于具具有这一一重要功功能，所所以叶绿绿体一直直是细胞胞生物学学、遗传传学和分分子生物物学的重重要研究究对象。叶叶绿体是是植

25、物细细胞中较较大的一一种细胞胞器，利利用低速速离心即即可分离离集中进进行各种种研究。 实 验 目目 的 1. 通过过植物细细胞叶绿绿体的分分离, 了解细细胞器分分离的一一般原理理和方法法。 2. 观察察叶绿体体的自发发荧光和和次生荧荧光, 并熟悉悉荧光显显微镜的的使用方方法。 实 验 原原 理 将组织匀浆浆后悬浮浮在等渗渗介质中中进行差差速离心心，是分分离细胞胞器的常常用方法法。一个个颗粒在在离心场场中的沉沉降速率率取决于于颗粒的的大小、形形状和密密度，也也同离心心力以及及悬浮介介质的粘粘度有关关。在一一给定的的离心场场中，同同一时间间内，密密度和大大小不同同的颗粒粒其沉降降速率不不同。依依次

26、增加加离心力力和离心心时间，就就能够使使非均一一悬浮液液中的颗颗粒按其其大小、密密度先后后分批沉沉降在离离心管底底部，分分批收集集即可获获得各种种亚细胞胞组分。 叶绿体的分分离应在在等渗溶溶液(00.355moll/L氯氯化钠或或0.44moll/L蔗蔗糖溶液液)中进进行, 以免渗渗透压的的改变使使叶绿体体到损伤伤。将匀匀浆液110000r/mmin的的条件下下离心22minn, 以以去除其其中的组组织残渣渣和未被被破碎的的完整细细胞。然然后，在在30000r/minn的条件件下离心心5miin，即即可获得得沉淀的的叶绿体体(混有有部分细细胞核)。分离离过程最最好在005的条件件下进行行；如果

27、果在室温温下，要要迅速分分离和观观察。 利用荧光显显微镜对对可发荧荧光的物物质进行行检测时时，将受受到许多多因素的的影响，如如温度、光光、淬灭灭剂等。因因此在荧荧光观察察时应抓抓紧时间间, 有有必要时时立即拍拍照。另另外，在在制作荧荧光显微微标本时时最好使使用无荧荧光载片片、盖片片和无荧荧光油。 实 验 用用 品 一、器材 1.主要设设备: 普通离离心机、组组织捣碎碎机、粗粗天平、荧荧光显微微镜。 2.小型器器材: 5000ml烧烧杯2个个, 2250mml量筒筒1个, 滴管管20支支, 110mll刻度离离心管220支, 试管管架5个个，纱布布若干，无无荧光载载片和盖盖片各44片。 二、材料

28、 新鲜菠菠菜。 三、试剂 0.335mool/LL氯化钠钠溶液，00.011%吖啶啶橙(aacriidinne oorannge)。 实 验 方方 法 一、叶绿体体的分离离与观察察 1. 选取取新鲜的的嫩菠菜菜叶，洗洗净擦干干后去除除叶梗脉脉，称330g于于1500ml 0.335mool/LL NaaCl溶溶液中，装装入组织织捣碎机机。 2. 利用用组织捣捣碎机低低速(550000r/mmin)匀桨335mmin。 3. 将匀匀浆用66层纱布布过滤于于5000ml烧烧杯中。 4. 取滤滤液4mml在110000r/mmin下下离心22minn。弃去去沉淀。 5. 将上上清液在在30000r/

29、minn下离心心5miin。弃弃去上清清液，沉沉淀即不不叶绿体体(混有有部分细细胞核)。 6. 将沉沉淀用00.355moll/LNNaCll溶液悬悬浮、 7. 取叶叶绿体悬悬液一滴滴滴于载载玻片上上，加盖盖玻片后后即可在在普通光光镜和荧荧光显微微镜下观观察。 (1)在普普通光镜镜下观察察。 (2)在荧荧光显微微镜下观观察叶绿绿体的直直接荧光光。 (3)在荧荧光显微微镜下观观察叶绿绿体的间间接荧光光：取叶叶绿体悬悬液一滴滴滴在无无荧光载载片上，再再滴加一一滴0.01%吖啶橙橙荧光染染料, 加盖片片后即可可在荧光光显微镜镜下观察察。 二、菠菜叶叶手切片片观察 用剔须刀片片将新鲜鲜的嫩菠菠菜叶切切削出一一斜面置置于载玻玻片上，滴滴加12滴00.355moll/L NaCCl溶液液，加盖盖片后轻轻压，置置显微镜