当归分子生药学课件

1、当 归当归的RAPD分析分子标记在当归研究中的应用当归种质资源的研究 黄璐琦简介 当归（学名：Angelica sinensis），为伞形科多年生草本植物，在中国分布于甘肃、云南、四川、青海、陕西、湖南、湖北、贵州等地，各地均有栽培。当归的根可入药，是最常用的中药之一。当归多糖生物学功能的研究进展分子标记在当归研究中的应用当归生物技术的研究现状与展望1. 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序 列变异为基础的遗传标记 ,是DNA水平遗传 多态性的直接反映。2. 应用于当归植物遗传多样性分析的分子遗 传标记主要有RFLP.RAPD.AFLP.ISSR.ITS等 一.分子标记在当归植物遗传多样性研究

2、中的应用 随机扩增多态性DNA(RAPD)： RAPD技术建立在 PCR技术基础上,用一系列(通常数百个)不同的随机排 列碱基序列的寡核苷酸单链作为引物,对所研究的基因组DNA进行单引物扩 增. RAPD应用于当归种质资源鉴定及遗传多样性等研究工作中. 扩增片段长度多态性(AFLP): AFLP是RFLP和PCR相结合的DNA分析技术,它结合了RFLP和RAPD的优点，既具有前者的可靠性, 又具有后者的方便性.现已被广泛应用于生物多样性 ,指纹图谱构建,遗传图谱构建,基因克隆等诸多领域. 当归组织培养的研究现状当归生物技术研究的总体现状 1.当归组织培养的研究现状: 国内有关当归组织培养研究的

3、文献始于1981年，在19812010年的30年间，共有文献17篇. 目前，当归生物技术的研究仅局限于当归组织培养与DNA分子标记方面，其他如当归发酵工程、酶工程及蛋白质工程，基因工程等生物技术的研究未见相关报道 2.国内当归生物技术研究的总体现状:s当归RAPD 分析s当归种子的RAPD 分析当归道地性RAPD 分析当归RAPD 反应条件的优化s注: M 为DNA Marker; 1 6 分别是表1 中的1 6 号材料。下同 图1 当归种子基因组DNA 电泳图谱 由图1 可知，用改良CTAB 法提取的当归种子基因组DNA 片段大小均在20 kb 左右，拖尾现象较少，DNA 降解少，完整性相对

4、较好，能够满足RAPD 反应对DNA 质量的要求。s图2 RAPD 分析电泳图谱图2 可知，除了1 号样品外，其余5 种材料均在250 bp 处有一特征性条带。因此S 61（随机引物） 可用于当归的鉴别。118 为样品编号图218 个当归样品的RAPD 聚类系统图s当归药材道地性的RAPD 分 对来自不同产地的18 个当归样品,提取其基因组DNA, 并进行RAPD 分析。s 图2 比较直观地表明绝大多数地理分布距离越近的样品, 如13 之间, 57 之间, 9, 10 之间及1118 之间, 在聚类树状图上的距离越近, 说明它们之间的遗传背景差异越小。反之, 地理分布距离越远的样品, 如上述各

5、组之间, 在聚类树状图上的距离越远, 说明它们之间的遗传背景差异越大。 RAPD 分子标记技术对揭示道地药材与非道地药材之间的地理生态遗传的差异将是一种十分有效的手段。s当归RAPD 反应条件的优化 为了确定最优的PCR 反应体系, 本试验选取了反应成分中模板浓度、Mg2+ 、引物浓度、dN TPs 的浓度、Tag 酶用量5 个重要因子设计L16 ( 4) 5 正交试验, 设计正交试验因素水平表( 表1)s正交试验结果及分析:上述L16 ( 4 ) 5正交表作PCR 扩增试验, 结果见图1。图1 正交试验的两次重复s结果分析：R 值的大小反映了该因素对结果影响的大小, 从表2 中可以看出, 在

6、试验范围内, 5 个因子中以T aq 酶用量影响最大, 其次为dNT Ps 浓度, 模板浓度和引物浓度这两项因子效应相差不大, MgCl2浓度影响最小。s 最后结果：5个试验因子的最适条件为: 模板DNA 0. 5 ng/ LL, 引物0. 8 Lmo l/ L, dNT Ps 0. 25 mmol/ L, MgCl2 2. 5 mmo l/ L, Taq 酶0. 8 U。当归主产区种质资源分析甘肃省 甘肃省是全国当归种植面积最大的省份，近年来培育出“岷归1号”、“岷归2号”两个新品系。云南省 鹤庆马厂是云南当归的道地产区，马厂当归也有“ 紫茎”和“绿茎”以“紫茎”种植面积占绝对优势, “绿茎

7、”极少见。四川省 四川省当归种植区主要分布在北部的九寨沟县、平武县、宝兴县、汉源县。湖北省 湖北省适合当归的种植地方主要集中在恩施、利川、建始等地。当归种质资源的RAPD分析 随机扩增DNA 多态性( Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) 技术已广泛应用于中草药种质资源遗传多样性及药材道地性的研究中.盛丽等人对来自甘肃省不同产区所栽培的20 个当归样品进行了RAPD 分析, 对其遗传多样性和亲缘关系进行了考证。1 RAPD多态性分析 从40 个随机引物中筛选出7条谱带清晰、多态性强并且重复性好的引物, 对供试的20份材料进行PCR扩增, 并对这7 个引

8、物的扩增结果进行统计分析(见表2）。 7条引物共扩增出82 个条带, 不同引物的扩增带数变幅为6-17 条, 平均每个引物可扩增出11.7 条带, 82条DNA 扩增带中, 58 条带具有多态性, 占70.7%, 每个引物可扩增出5-11 条多态性带, 平均为8.3 条.2.遗传相似系数 用NTSYS- pc 统计分析软件中的Dice 方法得到材料间的相似系数矩阵(表3) ,供试材料间相似系数值的变化范围为0.545-1.000, 相似系数值越大,材料间的遗传距离越小, 亲缘关系越近; 反之亲缘关系越远. 3 聚类分析 根据RAPD 数据得到的相似系数矩阵, 按UPGMA法进行聚类分析, 建立

9、聚类分支树状图( 图2)，供试样品可以聚为5 类： 第一类（9,11,13,20） 第二类（1-8,17,18） 第三类（14,15,16） 第四类（12,10） 第五类（19） 聚类分析结果显示绝大多数地理分布距离较近的样品, 如1-3 之间, 4-6 之间, 7、8 之间, 10、1 1、13 之间, 14-16 之间及17、1 8 之间, 在聚类树状图上的距离也较近, 说明它们之间的遗传背景差异较小.反之亦然。 但是生态条件特别是小生境对当归遗传差异的影响亦不可忽视, 如12 号样品和9, 10, 11, 13 号样品之间, 19 号, 20 号样品和17, 18 号样品之间在地理分布距

10、离上虽然较近, 但在分子系统树上的距离却较远, 说明它们之间的遗传差异相对较大, 这可能是由于样品之间小生境的不同造成的. 以上结果均表明,RAPD 标记技术能较好地反映不同产地当归亲缘关系的远近, 当归资源的遗传距离与其栽培地的地理分布距离有一定的相关性, 这有助于在一定程度上解释甘肃当归药材的道地性, 同时可证明RAPD 技术可用于药用植物分子生物学水平的种内鉴定与研究.基本信息姓 名：黄璐琦性 别：男 出生年月：1968年3月 学 位：博士毕业学校：北京大学医学部（原北京医科大学） 毕业时间：1995年导师类别：博士研究生导师研究方向：分子生药学，中药资源学人 物 名 片从事工作：现为中

11、国中医科学院副院长，中药研究所所长，首席研究员。学术兼职：国务院学位委员会中药学科评议组委员，世界卫生组织传统医学（中药）合作中心主任，国家药典委员会委员，中华中医药学会中药鉴定分会主任委员，中国中西医结合学会中药专业委员会主任委员，中国生态学会中药资源生态专业委员会主任委员，中国中药杂志副主编成就及荣誉分子生药学的提出提出时间：1995年提出背景：前提优点缺点生药学：是研究生药的一门科学。 研究生药的名称、来源、形态、性状、组织、成分、效用及生产、采制、贮藏等的学科。分子生物学：从分子水平上研究生命现象物质基础、的学科。研究细胞成分的物理、化学性质和变化及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗

12、传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。20 世纪末期, 分子生物学及相关学科的飞速发展, 极大地促进了生药学的发展, 其他学科及相关知识的渗入使得生药学的研究内容不断扩大, 技术方法不断更新, 生药学科的内涵和外延也不断延伸。如何认识生药的质量变异? 其物质基础是什么?生药优质药材(特别是道地药材)是如何形成的,其形成的分子遗传与环境机理是什么? 生药药效成分积累的生物学机理是什么? 受什么因素影响? 如何提高药效成分的含量? 当时提出时的展望： 在鉴定方面的应用 在生产方面的应用 在获取有效成分方面应用现代意义： 将生药的研究层次向微

13、观推进到基因(genes)水平, 极大地丰富了人们以往对生药生命现象的认识; 由于不同基因或DNA 片段的进化速度不同, 其在进化中的特殊地位不同, 所反映的遗传变异的尺度和水平也不同, 这一点强化了人们对生药细胞、组织、器官、有机体、种群等层次的重新认识和思考。主编书目参考文献： 1王燕,单体中.当归多糖的生物学功能的研究进展J.畜牧与饲料科学,2006(2):42-45. 2张尚智,刘玲玲,杨文玺,贺莉萍,韩黎明 .当归生物技术的研究现状与展望J.西北药学杂志,2012,27(5):496-499. 3廖朝林, 王华,廖璐婧,由金文,何美军,张宇,何银生.分子标记在当归属植物遗传多样性研究中的应用J. 湖北农业科学,2009,48(10):2598-2602. 4盛丽,王蒂,司怀军.甘肃省当归种质资源的RAPD分析J.甘肃农业大学学报，2007，42(4)：60-64s5李红军当归种苗组培繁育技术J.甘肃农业科技，2004(9):56. 6 盛 丽, 王 蒂,