非常好的 免疫组织化学技术在科研及临床中的课件

1、免疫病理学技术在科研及临床中的运用及意义广西医科大学第一附属医院病理科吕自力 党裔武 周颖川5356534免疫病理学一、免疫细胞化学二、免疫组织化学三、免疫荧光组织化学一、免疫细胞化学1、定义：利用已知抗体检测细胞爬片上细胞是否存在相应的抗原。2、原理：抗体+细胞抗原-显色3、运用：检测相关基因的表达二、免疫组织化学Immunohistochemistry, IHC原 理使用范围试剂配置操作步骤用途临床病理诊断：肿瘤分类诊断 上皮来源：CK，EMA 间叶来源：Vimentin 淋巴组织: LCA科研：组织抗原表达情况试剂准备切片(防脱片)多聚赖氨酸, APES一抗多抗or单抗,兔or鼠, 注意

2、种属特异性，针对检测组织种属检测试剂盒EliVisionTM plus 检测试剂盒（二步法）SP试剂盒（三步法）SABC试剂盒（三步法）显色试剂盒DAB试剂盒其他H2O2，二甲苯，酒精，缓冲液（PBS，柠檬酸缓冲液），抗原修复液（胰酶），正常动物非免疫血清高压修复pH=6.0柠檬酸盐缓冲液 大火加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中。 盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷汽，从喷汽开始计时，1-2分钟后 胰酶消化抗原修复于试管中加入一滴的胰酶浓缩剂和三滴稀释剂（1：3），均匀混合。 在组织切片上滴加100l（两滴）混匀的酶试剂。37孵育15-20

3、分钟。结果分析和判断（1）判断原则（2）对照设计（3）非特异染色（4）失败的原因及其处置方法阴性CK胞浆阳性细胞核阳性-PCNA胞核阳性胞膜阳性胞膜阳性（2）对照设计阳性对照：已知阳性表达的组织自身对照：同一标本中不同组织对照阴性对照： A、阴性组织对照：已知阴性表达的组织 B、阴性试剂对照：空白对照（3）非特异性染色原因组织内源性成分的干扰：内源性过氧化物酶-白细胞，红细胞内源性生物素-肝、胰、肾组织组织处理不当：内源性过氧化物酶-白细胞，红细胞内源性生物素-肝、胰、肾组织（4）染色失败的原因及处理方法试验片：-阳性对照片：-阴性对照片：-空白对照片：-结果：假阴性原因：操作步骤？试剂？试验

4、片：+阳性对照片：+阴性对照片：+空白对照片：+结果：假阳性原因：切片干涸抗体浓度过高缓冲液配制不对冲洗不彻底显色液配制不对显色时间过长载玻片的粘合剂过厚试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：+空白对照片：-结果：可疑阳性原因：阴性对照组织选择不准确，含有靶抗原试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：-空白对照片：-结果：阳性原因：方法可靠，实验片含靶抗原。阴性对照切片-，阳性对照标本和待检测切片呈弱阳性原因：标本固定不当抗体试剂问题：浓度、效价低抗原修复不当显色时间短切片染色深或整张切片出现染色抗体浓度过高切片显色时间过长组织没有正确封闭冲洗不够充分切片出现非特异性背景染色内源性过氧化物酶、内源性生物素过多血清封闭时间过短抗体不纯组织片内出血或坏死成分冲洗不彻底三、免疫荧光及免疫酶标双重或多重免疫荧光标记染色FITC-绿色TRITC-红色绿色+红色-黄色双重或多重免疫酶标记染色双酶双标记紫蓝色：AKP/NBT黄色：HRP/AEC双重或多重免疫酶标记染色单酶双底物HRP-DAB：棕色镍-鈷：黑色上皮：黑色淋巴：棕色抗体名称种属剂型预处理阳性定位阳性细胞Desmin（结蛋白） 鼠抗人，单抗即用胞浆肌肉组织Cyto